研究背景：　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下简称金葡菌）是引起医院和社区感染的一种严重致病菌，可导致化脓性关节炎、骨髓炎、脓毒血症、急性肺炎、心内膜炎、皮肤及软组织脓肿等严重感染并发症，且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点。美国每年约有9万例严重感染者，大约2万人死于其感染，超过艾滋病死亡人数，其死亡率高达20%。我国全国细菌耐药监测网（CARSS）的监测报告显示：金葡菌位居革兰阳性临床分离菌株首位，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ MRSA）检出率大于60%。目前金葡菌的感染流行和耐药性发展已成为全球高度关注的临床医学及公共卫生问题。WHO 于 2011 年即提出了“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”，并强调在未来重点支持创新性疫苗等免疫生物制品的研发。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌疫苗将对有效控制金葡菌广泛感染及大规模爆发流行、大幅降低金葡菌社区及院内感染的发病率及耐药性蔓延等方面具有重要的现实及战略意义。　　迄今为止，国外已有包括Nabi、Merck、Pfizer、GSK等公司的9个金葡菌疫苗先后进行了临床试验，包括重组单亚单位、重组多亚单位及荚膜多糖结合蛋白疫苗等疫苗形式，但均未研制成功。其中，Merck公司单一抗原组分的金葡菌疫苗V710和Nabi公司以荚膜多糖为抗原组分的金葡菌疫苗StaphVax均宣布临床试验失败。在总结分析其失败原因的基础上，国内外专家认为：金葡菌感染致病机制复杂，单一抗原作为疫苗难以实现对金葡菌感染的有效免疫保护，必须通过系统疫苗学技术体系筛选出针对金葡菌生存代谢、粘附定植、毒素分泌、免疫逃逸等关键靶点的抗原，一种能够涵盖金葡菌关键致病因子的“鸡尾酒”疫苗可能才是理想的金葡菌疫苗形式。　　本课题组前期在系统开展金葡菌感染的免疫防治研究中，通过反向疫苗学技术及大量的动物免疫攻毒保护评价实验研究，从金葡菌全基因组2742个开放阅读框（ORFs）中筛选并鉴定出了多个免疫优势抗原：铁离子表面决定簇B（IsdB）、凝集因子A（ClfA）、葡萄球菌蛋白A（SpA）、纤连素结合蛋白A（FnBPA）、金葡菌肠毒素B（SEB）和锰离子转运蛋白 C（MntC），在建立的金葡菌感染动物模型中证实均具有一定的免疫原性及免疫保护性。但单一抗原组分仅针对金葡菌单一致病靶点，保护力十分有限，开展多联多价抗原组合形式的研究是未来金葡菌疫苗发展的重要方向。　　研究目的：　　本研究在对筛选鉴定的6个金葡菌候选抗原进行结构分析、去毒突变、融合设计、配伍优化基础上，设计并制备了 3 种双组分金葡菌疫苗 IsdB151-277-ClfA33-213（IC）、SpA-DKKAA-FnBPA37-507（SF）和 mSEB+rMntC（S+M），采用 3 种动物模型（脓毒血症模型、皮肤感染模型和肺炎感染模型）分别进行了免疫原性检测、免疫保护评价及作用机制研究。为探讨金葡菌疫苗候选抗原两两组合、诱导协同免疫增强效应的可能性，研制多联多价的新型金葡菌疫苗提供重要的实验依据及技术支撑。　　研究方法：　　第一部分：双组分金葡菌疫苗IC的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 通过生物信息学方法，分析IsdB和ClfA蛋白的功能结构域，筛选免疫应答优势区域；通过PCR扩增目的基因片段，构建融合基因IC。经克隆、表达、纯化以及去除内毒素后，获得高纯度的双组分IC蛋白。经与适当浓度的AlPO4佐剂吸附后，制备而成双组分金葡菌疫苗IC。　　2. 双组分金葡菌疫苗IC经0、14、21天3针次免疫BALB/c小鼠，ELISA检测末次免疫后第 7 天血清中特异性抗体水平及脾细胞刺激后培养上清中的 IFN-r 和IL-17A水平；流式细胞技术（FACS）检测脾细胞Th1/Th17分化比例。采用2种动物模型（脓毒血症模型和肺炎模型）和4株不同来源金葡菌菌株（WHO2、BJ03、CQ19和GZ0），通过生存率、体温和体重的变化、各脏器细菌定植量、脏器病理评分检测，对双组分金葡菌疫苗IC进行免疫保护评价。　　3. 通过体外调理吞噬杀菌实验（OPK）和体内高免抗体过继实验，检测免后血清中功能性抗体水平和感染小鼠的被动免疫保护率，探讨双组分金葡菌疫苗IC特异性抗体介导的免疫保护机制；通过细胞因子功能抑制实验和 IL-17A-/-小鼠动物免疫攻毒实验，检测脏器细菌定植量，探讨双组分金葡菌疫苗IC特异性细胞免疫介导的免疫保护机制。　　第二部分：双组分金葡菌疫苗SF的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 通过生物学信息方法，分析FnBPA蛋白的功能结构域，筛选免疫应答优势区域；通过生物合成方法，突变SpA-D毒力位点，合成SpA-DKKAA-Linker。通过PCR扩增目的基因片段，构建融合基因 SF 基因。经克隆、表达、纯化以及去除内毒素，得到双组分SF蛋白。通过人IgG结合能力的测定以及B细胞毒性的测定，检测SF的生物学毒性。经与适当浓度AlPO4佐剂吸附后，制备双组分金葡菌疫苗SF。　　2. 双组分金葡菌疫苗SF经0、14、21天3针次免疫BALB/c小鼠，ELISA检测末次免疫后第7天血清中特异性抗体水平；脾细胞刺激实验检测脾细胞增殖指数及脾细胞培养上清中的 IFN-r、IL-5和 IL-17A水平。采用 3种动物模型（脓毒血症模型、肺炎模型和皮肤模型）和7种FnBPA亚型金葡菌菌株（8325-4、Mu50、MW2、JN56、KM22、SA77及SJZ31），通过生存率、体重变化百分比、各脏器细菌定植量、脏器病理评分及皮肤脓肿大小检测，对双组分金葡菌疫苗SF进行免疫保护评价。　　3. 通过OPK实验检测免后血清中功能性抗体水平；通过体内高免抗体过继实验，检测感染小鼠的被动免疫保护率，探讨双组分金葡菌疫苗 SF 特异性抗体介导的免疫保护机制。通过细胞因子功能抑制实验，检测脏器细菌定植量，探讨双组分金葡菌疫苗SF特异性细胞免疫介导的免疫保护机制。　　第三部分：双组分金葡菌疫苗S+M的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 通过生物信息学，检索SEB和MntC基因；经去毒突变，通过PCR构建mSEB和rMntC基因。经克隆、表达、纯化以及去除内毒素，得到mSEB和rMntC。基于纳米乳递送系统，制备双组分金葡菌疫苗 S+M。通过表面活性剂和助表面活性剂比（Smix）、油相比、蛋白终浓度以及加样顺序的摸索，对S+M制备工艺进行摸索。通过透射电镜和动态光散射，检测其粒径大小及分散性。通过 SDS-PAGE、质谱和稳定性实验，评价S+M疫苗的特异性和稳定性。　　2. 双组分金葡菌疫苗S+M经0、14、21天3针次免疫BALB/c小鼠，ELISA检测末次免疫后第7天血清及肺泡灌洗液（BALF）中特异性抗体及IFN-γ和IL-17A的水平；脾细胞刺激实验检测脾细胞培养上清中的IFN-r和IL-17A水平。采用2种免疫方式（滴鼻免疫和肌注免疫）和2种动物模型（脓毒血症模型和肺炎模型），通过生存率和脏器细菌定植量的检测，对双组分金葡菌疫苗S+M进行免疫保护评价。　　3. 通过OPK实验，检测免后血清及BALF中功能性抗体水平，探讨双组分金葡菌疫苗S+M特异性抗体介导的免疫保护机制；通过细胞因子功能抑制实验，检测脏器细菌定植量，探讨双组分金葡菌疫苗S+M特异性细胞免疫介导的免疫保护机制。　　研究结果：　　第一部分：双组分金葡菌疫苗IC的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 成功构建基因工程菌pGEX-6P-2-IC/XL1-Blue，经IPTG诱导后，疫苗蛋白IC以可溶形式表达，经GST亲和填料初纯、柱层析精纯及去内毒素后，目的蛋白HPLC纯度分析大于95%，BCA检测浓度为1.4 mg/mL。SDS-PAGE结果显示疫苗蛋白IC分子量为36kDa，与理论设计一致。疫苗蛋白IC与AlPO4佐剂（20mg/mL；400μg/dose）混合吸附后，制备得到0.4mg/mL的双组分金葡菌疫苗IC。　　2. ELISA检测双组分疫苗IC免后血清中产生了特异性IgG，脾细胞刺激实验显示脾细胞刺激上清产生了高水平的IFN-γ（2449.17 pg/mL）和IL-17A（918.90 pg/mL）；同时IC疫苗组脾细胞诱导产生高比例的Th1和Th17，均显著高于单组分疫苗组（P＜0.05）。在金葡菌脓毒血症动物模型中，IC 疫苗组保护率为 85%，显著高于单组分疫苗组（P＜ 0.05）；IC疫苗免后可显著降低外周血、脾脏和肾脏中细菌定植量及肾脏的病理损伤（P＜ 0.05）；同时对4株不同来源的金葡菌菌株均具有较好的交叉免疫保护作用。在金葡菌肺炎感染模型中，IC疫苗免疫后显著降低了肺脏的细菌定植量及病理损伤（P＜ 0.05）。　　3. 体外 OPK结果显示双组分疫苗 IC 免后血清对金葡菌的杀伤率为 70.17%；体内高免抗体过继实验显示，感染小鼠被动免疫保护率为80%，均显著高于单组分疫苗组（P＜ 0.05）。细胞因子功能抑制实验显示，单独阻断IL-17A可使脏器细菌定植量显著升高（P＜ 0.05），但是单独阻断IFN-γ并不影响脏器的细菌定植量（P＞0.05）。IL-17A-/-小鼠动物免疫攻毒实验显示，IL-17A-/-小鼠各脏器细菌定植量显著升高（P＜ 0.05）。　　第二部分：双组分金葡菌疫苗SF的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 成功构建基因工程菌pGEX-6P-2-SF/XL1-Blue，经IPTG诱导后，疫苗蛋白SF以可溶形式表达，经GST亲和填料初纯、柱层析精纯及去内毒素后，目的蛋白HPLC纯度分析大于 95%，BCA 检测浓度为 1.2 mg/mL。SDS-PAGE 结果显示疫苗蛋白 SF分子量为71kDa，与理论设计一致。通过人IgG结合能力检测以及B细胞毒性的检测，表明SF蛋白毒力突变成功，安全性良好。疫苗蛋白SF与AlPO4佐剂混合吸附后，制备得到0.4mg/mL的双组分金葡菌疫苗SF。　　2. ELISA检测双组分疫苗SF免后血清中产生了特异性IgG，脾细胞刺激实验显示脾细胞刺激上清产生了高水平的IFN-γ（1224.58 pg/mL）、IL-5（104.60 pg/mL）和IL-17A（735.12 pg/mL），均显著高于单组分疫苗组（P＜ 0.05）。在金葡菌脓毒血症动物模型中，SF疫苗组保护率为75%，显著高于单组分疫苗组（P＜ 0.05）；SF疫苗免后可显著降低外周血、脾脏和肾脏中细菌定植量及肾脏的病理损伤（P＜ 0.05）；同时对7株FnBPA亚型金葡菌菌株均具有较好的交叉免疫保护作用。在金葡菌肺炎感染模型中， SF疫苗免疫后显著降低了肺脏的细菌定植量及病理损伤（P＜ 0.05）；在金葡菌皮肤脓肿模型中，SF疫苗免疫后显著降低了皮肤脓肿大小、细菌定植量及病理损伤（P＜ 0.05）。　　3. 体外OPK结果显示双组分疫苗SF免后血清对3株金葡菌菌株（MRSA252、8325-4和MW2）均介导了65%以上的杀菌率；血清稀释3倍后仍对3株金葡菌菌株介导了50%以上的杀菌率。体内高免抗体过继实验显示，感染小鼠被动免疫保护率为50%，显著提升了小鼠的免疫保护效果（P＜ 0.05）。细胞因子功能抑制实验显示，阻断IL-17A可使脏器细菌定植量显著升高（P＜ 0.05）。　　第三部分：双组分金葡菌疫苗S+M的制备、免疫保护评价及机制研究　　1. 成功制备出mSEB和rMntC蛋白，HPLC纯度分析均大于95%，BCA检测mSEB和 rMntC 浓度为 2.0 mg/mL和 1.6 mg/mL。SDS-PAGE 结果显示疫苗蛋白 mSEB和rMntC的分子量在28kDa和33kDa左右，与理论设计一致。通过对S+M疫苗的工艺摸索，确定了疫苗的制备方式：Smix=5∶1、油相比（8∶2）、蛋白浓度为200μg/mL和加样顺序（SCOP）。透射电镜和动态光散射结果显示，S+M粒径小于100nm，颗粒分散性良好。SDS-PAGE实验、质谱实验和稳定性实验结果显示，S+M疫苗具有较好的特异性和稳定性。　　2. ELISA检测结果显示，双组分金葡菌疫苗S+M经肌注或滴鼻免疫均可在血清和BALF中诱导特异性IgG和IgA的应答以及IFN-γ和IL-17A细胞因子的应答。其中，S+M疫苗经滴鼻免疫诱导了最高水平的血清IgA、BALF-IgA以及BALF-IL-17A；S+M疫苗经肌注免疫诱导了最高水平的血清 IgG；同时 S+M疫苗的 2种免疫方式诱导产生了相当水平的 BALF-IgG（P＞ 0.05）。脾细胞刺激实验，S+M疫苗经滴鼻免疫诱导产生了最高水平的IL-17A应答（1133.67 pg/mL），显著高于经肌注免疫方式（P＜0.01）。在脓毒血症模型中，S+M 疫苗经肌注免疫可诱导 95%的保护率，显著高于滴鼻免疫方式（P＜ 0.001）；在肺炎感染模型中，S+M疫苗经滴鼻免疫可诱导90%的保护率，显著高经肌注免疫方式（P＜ 0.001）。　　3. OPK实验结果显示，S+M疫苗经肌注免疫在血清和BALF中诱导的杀菌率为86.2%和70.0%，经滴鼻免疫在血清和BALF中诱导的杀菌率为67.3%和62.5%，均大于 50%。细胞因子功能抑制实验显示，单独阻断 IL-17A 可使肺脏细菌定植量显著升高（P＜ 0.05）。　　研究结论：　　1. 设计并制备3种新型双组分疫苗IC、SF和S+M，疫苗蛋白原液可溶性好、纯度高；疫苗性状均一，质量稳定。　　2. 通过对免后血清检测，3种新型双组分疫苗均产生了针对各抗原组分的特异性IgG，总 IgG 水平显著高于单抗原组，诱导了高水平的特异性体液免疫应答。通过对脾细胞刺激检测，3 种新型双组分疫苗的脾细胞培养上清均检测到高浓度细胞因子，证明均诱导产生了高水平的细胞因子应答。在脓毒血症模型、肺炎模型及皮肤脓肿模型中，3 种新型双组分疫苗能有效降低细菌定植量和脏器损伤，同时具有良好的免疫保护作用。　　3. OPK试验证明3种疫苗免疫后血清在体外均具有调理吞噬杀菌活性。免后的特异性抗体过继实验表明，高免血清具有良好的被动免疫作用。细胞因子功能抑制实验和IL-17A-/-小鼠动物免疫攻毒实验表明，疫苗激发的IL-17A在免疫保护中扮演重要角色。　　4. 本研究针对6个候选抗原探索了3种不同组合形式疫苗，为探讨金葡菌疫苗抗原组合形式、协同免疫增强策略提供了实验基础，同时也为研制多联多价的新型金葡菌疫苗提供重要的实验依据及技术支撑。