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δ-生育三烯酚(δ-tocotrienol)是维生素E的重要组成成分,然而在关于维生素E的研究中大部分是研究生育酚,尤其是α-生育酚,然而最近研究表明δ-生育三烯酚(δ-tocotrienol)在抗炎和抗部分种类的癌症效果比生育酚更显著,并且δ-生育三烯酚比γ-生育三烯酚在多种肿瘤的抗癌效果方面甚至优于γ-生育三烯酚和维生素E的其他组份,然而对δ-生育三烯酚(δ-tocotrienol)抗炎以及抗鼻咽癌的分子机理并未有深入地研究。鼻咽癌是一种在中国南方、东南亚、非洲北部、中东和北极地区发病率比较高的癌症,所以在我们的日常饮食中能到找到有肿瘤化学预防的物质对于鼻咽癌高发区的人的健康有十分重要的意义。本课题采用超声法提取米糠油以及CO2超临界提取δ-生育三烯酚,并对δ-生育三烯酚用HPLC进行了检测,然后以RAW264.7和CNE1细胞为模型,评估δ-生育三烯酚对炎症的巨噬细胞RAW264.7体外模型和鼻咽癌的细胞模型的抗炎和抗癌的功效,在此基础上,探讨δ-生育三烯酚抗炎以及抗癌的分子机理,为进一步深入研究δ-生育三烯酚和开发δ-生育三烯酚的各种功能性食品、保健品提供科学的理论依据。1.δ-生育三烯酚的提取与检测将米糠干燥并粉碎,装入高压容器中。接下来在CO2超临界萃取装置上萃取米糠油并用分析天平定时称重。用高效液相色谱(HPLC)对米糠油进行分离和检测,得到的实验结果为δ-生育三烯酚在米糠油中的含量是132.7μg/kg.与标准品相对照,则分离的δ-生育三烯酚的纯度为96.2%。2.δ-生育三烯酚的抗炎功能及其分子机理研究为了从细胞层面的体外模型观察δ-生育三烯酚的抗炎作用,本研究利用RAW264.7细胞,观察δ-生育三烯酚对经过脂多糖(LPS)诱导后的RAW264.7细胞活性的抑制效果。首先,光学显微镜观察和MTS分析发现0-80μM浓度下δ-生育三烯酚对RAW264.7细胞的存活无显著毒性。脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7结果表明20、40、80μMδ-生育三烯酚能显著抑制RAW264.7的促炎因子的表达。LPS诱导组对比对照组,促炎因子TNFα、IL-6、IL-1β、i NOS的m RNA表达量和蛋白表达明显上升,对比LPS组,δ-生育三烯酚组能够降低这些m RNA和蛋白质表达,且结果呈现出一定剂量依赖关系。研究发现,ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化水平受到明显抑制,且呈剂量依赖性,说明δ-生育三烯酚在炎症反应中能抑制MAPK信号通路的活化,从而抑制转录因子AP-1、NF-κB活化和炎症因子的表达。结果表明,δ-生育三烯酚通过JNK和ERK1/2的磷酸化调节PPARα的磷酸化,通过调节由JNK和ERK1/2和p38来调节PPARγ,从而抑制炎症因子的表达。3.δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞CNE1的促使凋亡和抑制增殖作用及其分子机理研究本研究立足于评估δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞CNE1的促使凋亡和增殖的影响,发现在δ-生育三烯酚处理鼻咽癌CNE1细胞后,在光学显微镜和Hoechst33258荧光染色的细胞形态学方面在0-72 h间有明显的有促使凋亡的作用,并且连同MTS检测的结果表明δ-生育三烯酚对CNE1细胞增殖抑制率在0-80μM明显地呈剂量依赖特征。用细胞流式仪分别对δ-生育三烯酚处理的CNE1细胞的凋亡过程和增殖周期进行检测。在诱导凋亡方面通过Western blotδ-生育三烯酚明显地下调Bcl-2,而Bax,Caspase-3,Caspase-9等调控细胞凋亡的关键靶基因的转录和表达则上调并呈剂量依赖的特点,Caspase-8无明显变化。而在抑制增殖方面则明显地下调Cyclin D1,CDK2,CDK4,提示δ-生育三烯酚能下调细胞周期素的表达和抑制CDK的活性。通过实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白印迹发现,不同浓度的δ-生育三烯酚处理后,CDKI中p16、p18、p21、p27和p53表达明显上调,且呈剂量依赖性,但p15、p18和p19表达则无明显改变。说明δ-生育三烯酚可能通过下调细胞周期素的表达、抑制CDK的活性和上调一些CDKI表达阻滞细胞周期,从而抑制癌细胞的增殖。结果显示,δ-生育三烯酚通过p16/CDK4/cyclin D1引起CNE1细胞周期的阻滞。本研究运用了基因芯片来分析δ-生育三烯酚对CNE1细胞周期和细胞增殖的影响,发现有169个基因上调,167个基因下调。研究发现δ-生育三烯除了干预MAPK信号通路外,还能通过干预多条信号通路和多靶点抑制鼻咽癌的增殖。因此,δ-生育三烯酚通过Caspase-3信号通路触发CNE1细胞凋亡。这两个信号通路都受NF-κB调控。总的来说,我们认为δ-生育三烯醇在CNE1细胞中发挥抗癌作用的通路是NF-κB信号通路。