论文部分内容阅读
目的：1．研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)对离体小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响及其受体机制。2．观察HMGB1对腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)以及细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表达的影响。3．观察HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的时效及量效关系。4．研究半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)与核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)在HMGB1诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡中的信号作用途径。方法：1．分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，采用不同浓度的HMGB1(1、10、100、1000ng／ml)刺激6h，并以100ng／ml于不同时间点(6h、12h、24h、48h、72h)观察巨噬细胞摄取中性红能力、噻唑蓝法测定对L1210细胞的杀伤作用、应用Transwell小室趋化装置观察趋化活性变化，并采用流式细胞术检测细胞表面I-A~k抗原表达的变化。2．100ng／ml的HMGB1作用巨噬细胞48h后，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术检测细胞表面晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达。实验分为正常对照组、HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组、HMGB1+重组小鼠RAGE／Fc嵌合体(rmRAGE／Fc)组，分别观察巨噬细胞摄取中性红能力、对L1210细胞的杀伤作用、趋化活性、细胞表面I-A~k抗原表达的变化。3．分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，经不同浓度的HMGB1(1、10、100、1000ng／ml)作用24h，或以100ng／ml作用不同时间(6h、12h、24h、48h、72h)，采用实时荧光定量PCR方法测定细胞TNF-α、IL-10以及ICAM-1 mRNA表达的变化，酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-10以及sICAM-1蛋白水平的变化。4．分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，经不同浓度的HMGB1(10ng／ml、100ng／ml、1μg／ml、10μg／ml)刺激24h，或以10μg／ml的HMGB1作用不同时间(6h、12h、24h、48h)后，以Annexin V／7-AAD双染法，采用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜检测巨噬细胞凋亡的情况。5．10μg／mlHMGB1体外诱导巨噬细胞24h后，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术检测细胞表面RAGE的表达变化。细胞凋亡的实验分为正常对照组、HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组、HMGB1+rmRAGE／Fc组，以Annexin V／7-AAD双染法、流式细胞术检测巨噬细胞凋亡的变化，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡染色情况。6．分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，随机分为正常对照组、HMGB1组与caspase 3抑制剂组(HMGB1作用前1h加入caspase 3抑制剂Z-DEVD-FMK)。用Hoechst33342染色观察凋亡的形态学变化，采用Annexin V／7-AAD双染法、流式细胞术检测巨噬细胞凋亡百分率的变化；应用原位荧光染色，采用荧光显微镜及流式细胞术分析caspase 3活性的变化。同时使用ELISA检测NF-κB／p65DNA结合活性的变化。结果：(1)1-1000ng／ml的HMGB1刺激可使巨噬细胞的吞噬功能、杀伤活性、趋化活性及抗原呈递能力明显提高，其中以100ng／ml时作用最强，与对照组比较差异显著(P＜0.01)；100ng／ml HMGB1刺激48h细胞吞噬功能、杀伤活性及趋化活性达峰值(P＜0.01)，呈明显的时效及量效关系。(2)100ng／ml的HMGB1作用巨噬细胞48h后，细胞表面受体RAGE表达明显上调(P＜0.01)；HMGB1组巨噬细胞吞噬功能、杀伤活性、趋化活性及I-A~k抗原表达均显著高于对照组、HMGB1+抗RAGE组与HMGB1+rmRAGE／Fc组(P＜0.01)。(3)1-1000ng／ml的HMGB1作用24h，可促进巨噬细胞TNF-α、ICAM-1 mRNA表达增强，与对照组比较差异显著(P＜0.01)，其中HMGB1剂量为1000ng／ml时作用最强，呈剂量-效应关系。而IL-10仅在1000ng／ml时表达有所增加。采用100ng／ml的HMGB1作用不同时间后，培养上清液TNF-α与sICAM-1的浓度48h达高峰(P＜0.01)，呈时间-效应关系，HMGB1对巨噬细胞TNF-α的分泌呈“双峰”特征，而IL-10水平无变化。(4)经不同浓度的HMGB1刺激24h，其中10μg／ml组HMGB1诱导巨噬细胞凋亡效应最强(39.84±5.98％)，与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)。10μg／ml的HMGB1作用巨噬细胞不同时间后，以24h组凋亡率发生最高(38.30±6.95％)，明显高于对照组(P＜0.01)。(5)10μg／ml的HMGB1诱导巨噬细胞24h后，经流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜检测发现巨噬细胞表面受体RAGE表达明显上调(P＜0.01)；HMGB1组巨噬细胞凋亡率为(39.55±2.31)％，HMGB1+rmRAGE／Fc组为(14.83±4.78)％，HMGB1+抗RAGE抗体组为(17.29±3.59)％，显著高于对照组(5.37±2.31)％(P＜0.01)。(6)流式细胞术分析证实，HMGB1组巨噬细胞凋亡率为(38.21±4.85)％，caspase 3抑制剂组为(16.47±3.91)％，显著高于对照组(4.21±1.64)％(P＜0.01)。经Hoechst 33342染色、荧光显微镜观察HMGB1组凋亡细胞明显增多；同时，荧光显微镜显示HMGB1组caspase 3荧光强度明显增高，流式细胞术检测caspase 3阳性细胞百分率(29.74±4.55)％显著高于抑制剂组(3.02±1.91)％与对照组(7.19±2.46)％(P＜0.01)，而HMGB1组细胞核NF-κB／p65 DNA结合活性明显降低(P＜0.01)。结论：1．1-1000ng／ml的HMGB1可显著增强巨噬细胞的免疫功能。2．HMGB1作用于巨噬细胞，可显著促进TNF-α与ICAM-1的产生，HMGB1是重要的促炎因子。3．100-10000ng／ml的HMGB1可诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。4．caspase 3与NF-κB是HMGB1诱导巨噬细胞凋亡的重要途径，caspase 3抑制剂可部分阻断HMGB1诱导的巨噬细胞凋亡。5．HMGB1可诱导RAGE表达增加，RAGE是其影响巨噬细胞免疫功能的主要受体之一。