半月板无血运区损伤的修复是当今骨科学界的难题，组织工程学修复是最有前途的修复方法。软骨细胞作为半月板组织工程的种子细胞，存在体外扩增数量有限以及培养期间容易去分化的缺点，大大限制了其临床应用。骨髓基质干细胞(BMSCs)来源简单，具有多向分化潜能，在转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子的作用下，可以诱导分化为软骨细胞。而且它具有极强的快速增殖能力，扩增后能够达到原来细胞数目的10<10>～10<20>倍，能够满足组织工程种子细胞数量的要求。 聚羟基丁酸-羟基戊酸酯(PHBV)是微生物在碳、氧摄取失衡时合成的产物，它兼备生物材料和合成材料的许多优点。它具备生物性材料的无毒、可降解性，降解速度较一般生物材料慢，且又如同常见的合成材料一样，具有良好的机械性能。尤其特别的是，它是由聚羟基丁酸(PHB)和聚羟基戊酸(PHV)形成的共聚物，通过调整其中PHB和PHV的比例，可调节其机械强度和降解率。 先进行PHBV与绵羊BMSCs、软骨细胞的生物相容性研究，将BMSCs、软骨细胞分别接种在PHBV膜和三维泡沫样支架上，以扫描电镜观察接种后的细胞形态，计数1h，2h，6h时的细胞粘附率；并以接种至培养板上细胞为对照组，每日计数细胞数，绘制生长曲线；按培养液量与支架体积10ml/cm<3>为标准浓度制备浸提液，并制备标准浓度1/16～16倍的浸提液，以MTT法检测细胞毒性；流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期，计算增殖指数(PI)；细胞接种于PHBV三维支架上4、8、12 d，以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量，BCA法测定BMSCs内的蛋白质含量，二甲基亚甲蓝法测定软骨细胞内糖胺聚糖的含量。实验中，我们观察到，BMSCs接种至PHBV膜上2h，软骨细胞接种至PHBV膜上6h后，均大部分粘附，与对照组比较无显著性差异，绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异；MTT细胞毒性试验见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级；光、电镜观察见细胞接种于PHBV膜上3d后伸展良好，接种到支架上的细胞在三维支架的孔隙内立体生长，1周开始细胞问连接，3周广泛连接，分泌大量基质；流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化；接种到PHBV三维支架上的：BMSCs细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。这些表明，PHBV与BMSCs和软骨细胞都有着良好的生物相容性。实验中发现，接种到PHBV三维支架上的软骨细胞内DNA、GAG量明显高于生长于培养瓶中的软骨细胞，分析认为，这可能是由于生长于培养瓶中的软骨细胞是单层培养，培养期间发生了去分化现象，而生长在三维支架上的软骨细胞则能维持其正常表型。我们也发现，接种到PHBV膜上1h的BMSCs，1h、2h的软骨细胞黏附率都较对照组有显著性差异。分析认为，这可能是由于PHBV具有高分子合成材料的疏水性特点，表面缺乏亲水基团，导致细胞早期不易黏附。因此，对PHBV进行表面改性，以增加其亲水性，易于细胞早期黏附，可能有利于优化其作为组织工程材料的性能。 实验中，以光接枝法对PHBV进行表面改性，将改性前后的PHBV与BMSCs、软骨细胞共培养，通过比较两种材料上细胞的黏附率、扫描电镜观察、流式细胞仪检测以及定量测定细胞内DNA、蛋白质或GAG的含量，来分析PHBV经过改性后，是否更有利于细胞的早期黏附，是否有利于进一步增强其生物相容性。结果显示，接种到改性后PHBV膜上的BMSCs黏附率分别为：52.7﹪(1h)、74.2﹪(2h)、91.7﹪(6h)，接种后1h BMSCs的黏附率已显著高于未改性组，与正常培养板内细胞黏附率相当。接种到改性后PHBV膜上的软骨细胞黏附率分别为：47.0﹪(1h)、68.5﹪(2h)、92.5﹪(6h)，接种后1h、2h软骨细胞的黏附率已显著高于未改性组，与正常培养板内细胞黏附率相当。扫描电镜见改性后的PHBV膜表面更为粗糙，改性PHBV组的细胞黏附明显提前，且细胞数多于PHBV组，细胞分泌基质的量亦多于PHBV组。流式细胞分析显示两种材料上生长的软骨细胞、BMSCs细胞周期无差异。生长于两种材料上的BMSCs内DNA、蛋白质的量无变化，而改性后PHBV支架上的软骨细胞内DNA、GAG含量显著增高。这一系列实验结果表明，改性后的PHBV更易于细胞黏附，且具有了更佳的细胞相容性。 在取得前面实验结果的基础上，以改性的PHBV作为支架材料，应用诱导成软骨分化的绵羊BMSCs作为种子细胞，体外构建组织工程化半月板。实验中，将BMSCs接种至改性的PHBV三维泡沫样支架材料上，以TGF-β、IGF-1联合诱导BMSCs向成软骨分化，培养后的细胞支架复合物行扫描电镜观察，病理切片番红O、阿利新蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色，细胞内GAG含量测定。扫描电镜观察见诱导后1周，细胞形态由原来成纤维细胞样的长梭形向软骨细胞样的扁平形、圆形转化，细胞分泌的基质亦较BMSCs明显增加，且随着诱导时间的延长，这种变化更加明显。细胞支架复合物的番红O、阿利新蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性，显示了复合物已经具备了软骨组织特征性的分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力。细胞分泌GAG能力的检测显示，诱导后的BMSCs分泌GAG的量显著增加，但仍低于正常的2代软骨细胞。这表明，虽然成软骨诱导后的BMSCs已具备了软骨细胞的特征性功能，但与正常生理功能的软骨细胞尚有差距。 为了进一步验证体外构建的软骨样组织对于修复半月板无血运区损伤的能力，本文的最后一部分，我们进行了实验动物绵羊的体内实验研究。半月板损伤的模型由延半月板纵轴方向，在其体部无血运区手术切开而获得。考虑到支架材料表面的多孔样结构可能对股骨髁、胫骨平台面的关节软骨形成磨损，在将体外构建的软骨样组织植入绵羊半月板损伤处前，先将其埋植于动物皮下4周，待其周围形成肉芽组织包裹后再植入膝关节内半月板损伤处(D组)。实验中，我们设置了半月板损伤后不处理(A组)、单纯植入支架(B组)和直接植入体外构建的软骨样组织(C组)三组，作为对照。结果显示，半月板损伤后不处理和单纯植入支架，均不能实现损伤的修复；C组的组织直接植入后，半月板损伤虽然得到了修复，但损伤相对应的股骨髁或胫骨平台面关节软骨术后3月即见不同程度的磨损，6月时更为显著；而将体外构建获得组织先埋植皮下4周后再植入半月板损伤后，不但半月板损伤得到了修复，股骨髁和胫骨平台面的软骨亦得到了较好的保护，直至术后6月才出现早期退变的倾向。 总结全文，得出如下结论：①PHBV经过光接枝表面改性后，细胞黏附率得到了提高，细胞相容性得到了增强。②应用改性的PHBV作为支架材料，诱导成软骨分化的BMSCs为种子细胞，能够成功在体外构建出软骨样组织。③应用该组织植入半月板无血运区的纵形损伤处，能够修复半月板损伤。植入前，先埋植于皮下4周，有助于减轻材料对关节软骨的磨损。