第一部分:NMR分析PCOS患者卵泡液中代谢物改变及对胚胎发育质量的影响目的PCOS是引起育龄期女性无排卵及不孕的主要原因之一。本文通过收集PCOS患者和正常对照人群进行辅助生殖助孕过程中产生的卵泡液,采用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)测定其中代谢物的存在及其浓度差异,从卵泡发育的局部代谢微环境揭示PCOS患者卵泡与正常人群卵泡发育的差异,为了解PCOS的病因和改善妊娠结局提供新的思路。方法1.研究对象:研究对象为2014年期间于武汉大学人民医院行IVF-ET或ICSI助孕的患者。正常对照组36例和PCOS组15例。2.控制性卵巢刺激方案:所有研究对象均采用标准长方案促排卵。定期监测卵泡发育情况和血清性激素水平至HCG注射日。在促排卵过程中根据卵泡发育情况和激素水平调整药物用量。3.采卵和卵泡液收集:在定期监测排卵的过程中,当双侧卵巢出现至少2个卵泡直径大于18mm后给予HCG I0000U肌肉注射。HCG注射后34-36小时在引导超声的引导下穿刺采卵。卵细胞置于培养基中培养,卵泡液收集于EP管中。收集的卵泡液于4℃,12000rpm离心10分钟,收集上清液,-80℃冻存,进行下一步的检测。4.受精和胚胎质量评估:采卵后3小时受精,继而将其移至新的培养基中。观察2原核出现情况并记录。对D3胚胎进行形态学评价。5.NMR样品准备:将卵泡液样品从-80℃冰箱内取出,依次解冻、充分震荡、离心,然后每个样品移取530μL到5mm核磁管内,将一个装有60μL TSP(3-三甲基硅基-丙酸钠)D20溶液的同轴离心管置入核磁管内作为位移外标(CH3,δ0.00)。6.NMR图谱采集:将样品在25℃下,以随机顺序置入BrukerDRX 500MHz核磁共振谱仪,以CMPG脉冲序列采集记录NMR谱图。实验参数为预扫(DS)16次,累积扫描(NS)128次,采样数据点(TD)32K,谱宽(SW)6000 Hz、预扫延迟时间(DE)为30μs、混合时间(tm)为0.1s等。7.NMR图谱分析:运用MestReNova软件(version 6.6.1)对谱图进行基线及相位调整预的处理后,用1.46 ppm处的来自丙氨酸的特征双峰将每个谱图进行对齐。接着,分别对每个样品的谱图数据点进行适当合并,每个谱图最终合并成为含有4000个数据点的谱图,每个点之间相隔0.003ppm。将谱图中残留的水和尿素区(δ4.7～5.2 ppm)去除后,参考总谱图积分(δ10～0.40 ppm)对每个谱图进行归一化。将归一化后的谱图以平均值为中心进行预处理后,依次运用非监督性模型主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和监督性模型偏最小二乘法回归分析(partial least-squares,PLS)、正交修正-偏最小二乘法回归分析(orthogonal signal correction partial least-squares,OSC-PLS)对整体谱图进行全面观测,以发掘PCOS与正常对照组间的区别。8.PCOS差异代谢物定位:参照文献及数据库(HMDB),进一步对NMR特征峰进行识别和积分。运用t检验和多重检验校正(Bonferroni校正),对识别出的特征峰进行显著性检验,找出在PCOS卵泡液中呈显著差异(p<0.05),以及较显著差异(p<0.1)的代谢物。结果1.卵泡液中的代谢改变:由PCOS患者和正常对照组卵泡液的平均谱图对比,我们可以看到一些显著的差异代谢物的信号:包括丙氨酸、乳酸、胆固醇、和丙酮酸。在PLS得分图中PCOS和正常对照组这两类人群是分离的。OSC-PLS得分图更为清晰地呈现了两组间的差异。59 pks模型结果显示总体的准确度是0.68±0.06,灵敏度是 0.62±0.10,特异性是 0.71±0.08,AUROC 是 0.77±0.08。2.滤波器法选择生物标志物:PLS负载分析显示乙酸、胆碱、甘油和脂区、糖蛋白、谷氨酸是在LV1得分分离中贡献最大的5大代谢产物。OSC-PLS负荷分析表明醋酸、α-羟丁酸、乙酰乙酸、甘油和脂区、异亮氨酸(PK 58)有最高的载重量。p值选择模型显示在PCOS中呈升高趋势的有甘油和脂质区域,糖蛋白,乙酸盐,胆固醇;在PCOS中呈下降趋势的有乳酸,谷氨酰胺,丙酮酸和丙氨酸。这9种代谢物组合构建了 PLS-DA模型(p值选择模型),采用交义结果验证显示器具有0.73的灵敏度,0.86的特异度和0.88的AUROC。这个模型进一步使用MCCV算法进行验证,结果显示其平均灵敏度和特异性分别为 0.72±0.08 和0.81±0.04。3.L-1 Penalized Logistic回归法选择生物标志物:所有的样本结合59个特征峰区域采用L-1 Penalized Logistic回归法分析结果显示,包括谷氨酰胺、丙酮酸、醋酸和胆固醇在内的代谢物特征峰区域在PCOS和正常对照者卵泡液标本中均存在显著性差异。与正常对照组相比谷氨酰胺、丙酮酸在PCOS患者的卵泡液中含量减少,而胆固醇和乙酸的含量在PCOS的卵泡液中明显升高。特别是乙酸的变化率高达41%。使用这5种区域构建了 PLS-DA模型。交叉分析结果验证了该模型的灵敏度为0.73,特异性为0.83,AUROC是0.86。进一步使用MCCV算法评估PLS-DA模型,结果显示其准确度为0.79±0.03和AUROC为0.87±0.02。丙酮酸、醋酸、胆固醇均在100%预测准确率的模型中出现。利用这三种物质建立PLS-DA模型。交叉验证结果显示其灵敏度是0.80,特异度是0.83,AUROC 是 0.90。4.PCOS患者卵泡液代谢途径的改变:两组之间平p值小于0.05的所有代谢物都被导入MetPA,结果显示在PCOS卵泡液中改变的代谢途径包括丙酮酸代谢、糖酵解、丙氨酸、大冬氨酸和谷氨酸代谢等。5.代谢物与卵细胞发育潜能之间的相关性分析:我们将收集的辅助生殖中获得的临床数据与用NMR从卵泡液中检测到的代谢物进行相关性分析,发现优质胚胎率与肌酸呈紧密的负相关关系,且PCOS病人卵泡液中的组氨酸与优胚率呈非常显著的特异相关性(p-value=4.8E-3)。另外,PCOS卵泡液中的甲酸、葡萄糖,和羟基丁酸也显示出与其他卵细胞发育指数(卵裂率和受精率)明显的相关性。结论1.无论是得分图还是59-pks的PLS-DA模型都显示正常对照人群和PCOS患者的卵泡液样本中物质成分存在明显的分离,从而说明通过比较两组参与者卵泡液代谢产物的差异可以用于鉴别其母体状态。2.相比于59种代谢物构建的模型,用p<0.05的9个代谢物区域构建的模型在鉴别PCOS患者和正常组的灵敏度、特异度和AUROC等各方面均有所改善。3.建立在丙酮酸、醋酸、胆固醇上的PLS-DA模型对于PCOS患者和正常对照人群具备更好的鉴别能力。4.与对照组相比PCOS患者的酸代谢、糖酵解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代谢途径存在差异。5.卵泡液中组氨酸、甲酸、葡萄糖,和羟基丁酸与卵细胞发育潜能密切相关。第二部分:PCOS患者卵泡液中核酸代谢产物的表达差异及其对于胚胎发育潜能和妊娠结局的预测能力目的在妇科生殖领域,PCOS是引起女性不孕的常见原因之一。本文通过收集PCOS患者和正常对照人群进行辅助生殖助孕过程中产生的卵泡液,并采用质谱分析以测定其中核酸代谢物的存在及其浓度差异,进而与胚胎发育潜能进行相关性分析,并比较了其对于妊娠结局的预测能力,从而为了解PCOS的病因和改善妊娠结局提供新的思路。方法1.研究对象:2014年期间于武汉大学人民医院行体外受精-胚胎移植或卵泡浆内单精子注射助孕的患者。正常对照组和PCOS组各16例。2.控制性卵巢刺激方案:采用标准长方案促排卵。定期监测卵泡发育情况和血清性激素水平至HCG注射日。在促排卵过程中根据卵泡发育情况和激素水平调整药物用量。3.采卵和卵泡液收集:在定期监测排卵的过程中,当双侧卵巢出现至少2个卵泡直径大于18mm后给予HCG肌肉注射,注射后34-36小时在阴道超声的引导下穿刺采卵。卵细胞置于培养基中培养,卵泡液收集于EP管中。收集的卵泡液于4℃,12000rpm离心10分钟,收集上清液,-80℃冻存,进行下一步的检测。4.受精和胚胎质量评估:采卵后3小时受精,继而将其移至新的培养基中。观察2原核出现情况并记录。进行卵裂期第三天(D3)胚胎质量评价。5.统计学分析:所有数据均以均数±标准差表示,并使用SPSS19.0统计学软件进行分析。Kolmogorov-Smirnov检验以评价数据的正态性,正态分布的数据使用独立样本T检验进行分析,非正太分布的数据使用Kruskal-Wallis检验进行分析。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC 曲线)分析用以评价5’-脱氧腺苷,5-甲基胞嘧啶和5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷对妊娠结局的预测能力。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.参与者的一般特征:PCOS组患者的平均年龄为28.6±2.68,正常对照组的平均年龄为29.5±2.45,两组之间无统计学差异。由于PCOS疾病本身的代谢特点,与正常对照组相比PCOS组具有更高的体重指数(23.49±4.06 vs 20.39±2.10,p=0.01)。与正常对照组相比,PCOS组LH/FSH的比值升高(1.08±0.62 vs 0.70±0.41,p=0.48),AMH 升高(4.21±0.29vs2.26±0.26,p<0.001)。绝大多数的参与者采用IVF-ET方式助孕(53%),余下的47%采用ICSI方式助孕。最终,41%的参与者成功妊娠。2.参与者的实验室信息:与正常对照组相比,PCOS组患者表现出不同的促排卵结局,主要包括基础窦卵泡计数增加,获卵数增加,2 PN受精数增加,优胚数增加,而2PN卵裂数在两组参与者之间无明显差异。3.5’-脱氧腺苷,5-甲基胞嘧啶和5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷在PCOS组患者和正常对照组的卵泡液中的浓度差异:5’-脱氧腺苷(p=0.001)和5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷(p=0.005)在PCOS组患者卵泡液样本中的含量明显高于正常健康人群。而与正常健康人群相比,5-甲基胞嘧啶(p=0.002)在PCOS组卵泡液样品中的表达是明显降低的。由于这几种物质在卵泡液中的含量相对较低,其标准差均较大,但是这几组之间存在统计学差异。4.5’-脱氧腺苷的浓度,5-甲基胞嘧啶和5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与卵细胞发育能力的相关性分析:5’-脱氧腺苷的浓度与卵泡发育潜能正相关,主要表现为与获卵数具有0.389的相关系数(p=0.028),与2PN受精数具有0.527的相关系数(p=0.002),与2PN卵裂数具有0.520的相关系数(p=0.002),与优胚数具有0.506的相关系数(p=0.003)。在对所有的PCOS卵泡液样本中的5’-脱氧腺苷的浓度与卵细胞质量进行相关性分析之后,我们发现5’-脱氧腺苷的浓度与2PN受精数具有0.521的相关系数(p=0.039),与2PN卵裂具有0.513的相关系数(p=0.042),与优胚数具有0.570的相关系数(p=0.021),即5’-脱氧腺苷的浓度与卵细胞质量中度相关。然而,在健康对照人群里5’-脱氧腺苷的浓度不具有明显的相关性。我们也发现5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与卵细胞的发育潜能中度正相关。表现为与获卵数具有0.572的相关系数(p=0.00]),与2PN受精数具有0.679的相关系数(p<0.001),与2PN卵裂具有0.684的相关系数(p<0.001)。而在PCOS患者卵泡液样本中分析5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与卵细胞的发育潜能,我们也得到了相同的结果。表现为与获卵数具有0.516的相关系数(p=0.041),与2PN受精数具有0.685的相关系数(p=0.003),与2PN卵裂数具有0.695的相关系数(p=0.003),与优胚数具有0.816的相关系数(p<0.001)。然而,在健康对照人群的卵泡液样品中分析5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与卵细胞的发育潜能,没有发现明显的相关性。5.卵泡液样本中5’-脱氧腺苷,5-甲基胞嘧啶,5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度和2PN受精率之间的相关性分析:5’-脱氧腺苷的浓度和2PN受精率之间存在明显的正相关,表现为在所有的参与对象里分析具有0.226的相关系数(p=0.213),在正常对照组进行分析具有0.499的相关系数(p=0.049),在PCOS人群里进行分析具有0.530的相关系数(p=0.035)。与此同时,我们发现卵泡液中5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与2PN受精率高度正相关,表现为对在PCOS患者人群中具有0.627的相关系数(p=0.009)。而在健康对照人群中以及所有参与者中进行分析未见明显的相关性。6.卵泡液中5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度对于妊娠结局是一个很好的预测指标:在前期研究的基础上我们推测卵泡液中核酸结合物的浓度可能是预测临床妊娠结局的潜在的预测指标。我们通过分析卵泡液中5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与妊娠结果的关系发现,5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度对于妊娠结局具有很好的预测能力,表现为95%的AUC是0.942。对PCOS患者卵泡液中5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与妊娠结局进行分析,我们也得到了相同的结果,但是无明显的统计学差异。结论1.与正常对照组相比,PCOS组患者表现出不同的促排卵结局,主要包括基础窦卵泡计数增加,获卵数增加,2PN受精数增加,优胚数增加,而2PN卵裂数在两组参与者之间无明显差异。2.5’-脱氧腺苷和5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷在PCOS组患者卵泡液样本中的含量明显高于正常健康人群。而与正常健康人群相比,5-甲基胞嘧啶在PCOS组卵泡液样品中的表达是明显降低的。3.5’-脱氧腺苷的浓度与卵细胞发育潜能正相关;5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度与卵细胞的发育潜能中度正相关。4.卵泡液中5-甲氧羰基甲基-2’-硫尿核苷的浓度对于妊娠结局是一个很好的预测指标。