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目的肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤,其死亡率已占癌症死亡率之首。吸烟已被公认为引起肺癌的最重要的致癌因素之一。烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptors, nAchRs)信号途径是近年来肺癌靶向研究的热点。全基因组关联分析表明,编码α5-烟碱型乙酰胆碱受体(α5-nAchR)的CHRNA5基因与肺癌发生尤为相关,但α5-nAchR在肺癌发生中作用及机制的研究尚在起步阶段。本研究以非小细胞肺癌细胞株A549,H1299,H1975为研究对象,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定尼古丁促细胞增殖的最适作用时间和浓度,观察不同细胞株对尼古丁的敏感性；构建细胞饥饿模型,在尼古丁作用下,通过Western blot研究α5-nAchR及细胞增殖信号通路下游信号分子p-Src418,p-Raf340,341-1,p-Rb807的表达变化。设计CHRNA5-siRNA片段并经脂质体介导转染人肺癌A549细胞,通过荧光显微镜观察转染效率,荧光定量PCR以及Westernblot等实验方法,研究探讨siRNA干扰CHRNA5基因表达对人肺腺癌A549细胞增殖的影响以及对下游信号通路的影响及机制。本研究旨在阐明α5-nAchR对尼古丁促人肺腺癌细胞增殖的影响及机制,为揭示肺癌的分子病理机制提供的实验依据,对寻找肿瘤有效预防、治疗新靶点工作有重要的现实意义。方法1.通过基因测序法筛选三株α5-nAchR SNP398不同基因型的肺腺癌细胞株,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测比较在不同浓度和不同时间下尼古丁对三株细胞细胞增殖的影响。2.构建细胞饥饿模型,在尼古丁作用下,通过Western blot等方法检测α5-nAchR及细胞增殖Raf/MEK/ERK信号通路相关分子p-Src418,p-Raf340.341-1,p-Rb807的表达变化。3.设计合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染人肺癌A549细胞。荧光显微镜观察转染效率,荧光定量PCR、Western blot方法检测细胞转染后α5-nAchR mRNA和蛋白表达。4.采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT)观察siRNA干扰CHRNA5表达对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖的影响。5.尼古丁处理组和(RNAi干扰+尼古丁处理)组,比较分析细细胞增殖Raf/MEK/ERK信号通路相关分p-Src418,p-Raf340.341-1,p-Rb807的表达变化,探讨α5-nAchR在尼古丁促进细胞增殖的作用及机制。结果1.A549、H1299和H1975细胞株的SNP398基因型分别为野生型(A/A),基因突变纯合型(A/G)和杂合型(G/G)。尼古丁促进肺腺癌细胞株的细胞增殖,且存在与剂量和时间的相关性。A549和H1299细胞在1μM/L尼古丁处理24h后,细胞增殖最为显著(PA549<0.01,PH1299<0.05)。而H1975细胞在10μM/L尼古丁处理24h时后,细胞增殖最显著(PH1975<0.01)。2.0.5%新生牛血清作用48小时,使细胞处于饥饿状态,在尼古丁的作用下,与阴性对照组相比,p-Src418、p-Raf：340.341-1、p-Rb807分别在15分钟、2小时和6小时被激活(P<0.05)。3. CHRNA5-siRNA可显著抑制A549细胞中CHRNA5 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05)。4.RNA干扰下调CHRNA5表达后,肺癌细胞生长速度趋于降低。在尼古丁的作用下,与对照组相比,RNAi转染组A549细胞的增殖明显受抑制(P<0.01)。(RNAi干扰+尼古丁处理)组与尼古丁处理组相比,影响细胞增殖相关分子p-Src418,p-Raf340.341-1,p-Rb807的表达。其中,p-Src4418,p-Rar340.341-1激活受到抑制,p-Rb807去磷酸化作用减弱(P<0.05)。结论1.α5-nAchR SNP398变异体肺腺癌细胞株对尼古丁的敏感性不同,表明α5-nAchR SNP398基因多态性可能参与肺腺癌细胞对尼古丁的应答。2.siRNA干扰沉默CHRNA5在肺癌细胞中的表达可以抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖,提示CHRNA5可能是肺癌治疗的潜在靶点之一。3.α5-nAchR参与Raf/MAPK激酶/ERK信号通路促进非小细胞肺癌的细胞增殖,为肺癌病因学和靶向治疗研究提供新的实验依据。