肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人体最常见的恶性肿瘤之一。恶性度高、预后差，严重威胁着人类生命与健康。目前，手术切除仍是治疗肝癌首选和较有效的方法。化疗作为肝癌一项重要的辅助治疗手段，但对正常细胞毒性和肿瘤细胞的耐药性是化疗面临的两大难题。因此，寻找新型有效的药物成为研究的热点。近年来，高度发展的细胞生物学研究使人们认识到细胞凋亡和肿瘤的血管生成在防治肿瘤的过程中起着关键性的作用。近期的一系列研究提示，过氧化物酶增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ)可以作为许多疾病的治疗位点，如肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症、动脉硬化和肿瘤的预防和治疗等。随人们对它的研究不断深入，已发现它在脂肪代谢、介导组织的胰岛素敏感性、组织的炎症、细胞的分化和细胞周期的控制中起到十分重要的作用。根据上述的研究进展，我们相信：通过分析PPARγ的激活异常，将为治疗肿瘤提供新线索和新思路。结合传统的细胞毒性药物，新型的生物学靶药物将有力地推动肿瘤的生物治疗。本课题拟通过PPARγ激动剂ciglitazone对肝癌细胞增殖与凋亡的影响，及对肝癌细胞生长的作用机理进行实验研究，其科学意义在于1．本项目针对影响化疗效果的直接原因，探索肿瘤治疗的新策略，对提高化疗效果及新型、高效低毒抗癌药物的研制将提供新的理论依据，2．本课题在肿瘤治疗新领域内进行具有广泛应用前景的探索，将能够更快、更有效的应用于临床。本实验分以下四部分。第一部分过氧化物酶增殖物激活受体γ在肝癌细胞中的表达和意义目的：检测PPARγ在肝癌细胞中的表达，并探讨其可能意义。方法：采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术，研究肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721和正常肝细胞系L02中PPARγmRNA和蛋白的表达。结果：2株肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721和正常肝细胞系L02中均表达PPARγmRNA和蛋白，但PPARγ在2株肝癌细胞中的表达明显高于L02细胞。结论：PPARγ在肝癌细胞中表达上调，可作为肝癌治疗的一个新靶点。第二部分过氧化物酶增殖物激活受体γ活化对肝癌细胞周期停滞的诱导作用ⅠCiglitazone对肝癌细胞增殖与凋亡的影响目的：研究PPARγ激动剂ciglitazone对肝癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：培养HepG2细胞，加入不同浓度的ciglitazone，采用倒置相差显微镜、MTT增殖试验、流式细胞仪和western-blot技术检测不同时间段内细胞凋亡的大体形态学、细胞增殖改变、凋亡指数的改变。结果：HepG2细胞在加入ciglitazone 10μmol／L、25μmol／L和50μmol／L三种浓度作用下，第1、3天时细胞生长良好，第5天，50μmol／L ciglitazon作用下，凋亡细胞数目增多，而在第7天，以上三种浓度作用下的细胞均出现核固缩等典型细胞凋亡形态，50μmol／L ciglitazone的作用最为明显，三种浓度在第7天，细胞凋亡指数分别为7.90％、28.18％和38.36％，呈现明显时间和剂量依赖性。结论：Ciglitazone可抑制肝癌细胞生长，并诱导其发生凋亡，且呈明显的时间及剂量依赖性。ⅡCiglitazone对肝癌细胞生长影响的作用机理目的：研究PPARγ激动剂ciglitazone对肝癌细胞生长的作用机理。方法：培养HepG2细胞，加入50μmol／L的ciglitazone，在第7天采用western-blot技术检测细胞周期蛋白和caspase3活性的改变。结果：HepG2细胞在ciglitazone 50μmol／L浓度作用下7天，细胞周期蛋白cyclin D1表达降低，P21表达增加，caspase3表达增高。结论：Ciglitazone可抑制肝癌细胞增殖，诱导其发生凋亡的机理与细胞周期蛋白和caspase3的活性改变有关。第三部分抑制NF-κB活性增加ciglitazone诱导肝癌细胞凋亡的作用目的：探讨抑制NF-κB活性在过氧化物酶增殖物激活受体γ激动剂ciglitazone对肝癌细胞HepG2凋亡中的影响。方法：NF-κB特异性的吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)50μmol／L加入人肝癌细胞HepG2中，凝胶迁移率实验(electrophoreretic mobility shift assay，EMSA)检测NF-κB活性的变化，进而以浓度为50μmol／L的ciglitazone处理细胞7天，采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，Western blot观察处理前Bcl—2、Bax蛋白在凋亡过程中的变化，DEVD-pNA降解法检测caspase 3的活性变化。结果：①EMSA显示NF-κB活性明显下降；②抑制NF-κB活性可增强ciglitazone对HepG2细胞增殖的抑制作用③Bcl—2表达的减少及Bax表达增加，caspase 3的活性增加。结论：抑制NF-κB活性能增加肝癌细胞HepG2对ciglitazone的敏感性。第四部分Ciglitazone对裸鼠肝癌移植瘤的治疗作用机理ⅠCiglitazone对裸鼠肝癌移植瘤血管生成抑制作用目的：探讨过氧化物酶增殖激活受体γ配体ciglitazone在肝癌治疗中对血管生成的作用。方法：3周龄裸鼠随机分为实验组(10只)、对照组(10只)。皮下接种HepG2肝癌细胞，待肿瘤生长至约0.5cm时，实验组瘤内注射50μmol／L的ciglitazone 100ul，对照组注射100ul生理盐水，隔天注射连续15次。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测第31天的肝癌组织标本内PPARγ的表达，免疫组化法和蛋白质定量分析法(Western blot)测定癌组织中因子Ⅷ和VEGF的表达。结果：肝癌组织内存在PPARγ的表达，实验组的瘤块体积小、生长慢于对照组[(207.5±192.9)mm~3vs(445.0±150.9)mm.3，p＜0.05，实验组裸鼠体内肿瘤MVD低于对照组[11.0±7.6 vs 18.9±7.0，p＜0.05]，实验组裸鼠体内肿瘤VEGF的表达低于对照组，两者具有显著性差异。结论：Ciglitazone对肝癌的生长具有抑制作用，抗肿瘤血管形成可能是其中的作用机理之一。Ⅱciglitazone对人肝癌细胞株HepG2体内生长的影响目的：研究过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)激动剂ciglitazone对人肝癌细胞株HepG2体内生长影响的可能机制。方法：建立裸鼠肝癌动物模型，随机将其分为两组：对照组(A组，10只)，ciglitazone注射组(B组，10只)，B组隔天注射ciglitazone 100μl(50μmol／L)连续15次，对照组注射100μl生理盐水，1月后，切除瘤灶、称瘤重、计算抑瘤率。标本用Western blot检测细胞周期素D1(cyclinD1)、细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21蛋白、凋亡蛋白caspase3的表达。结果：ciglitazone治疗后，A组的cyclinD1较B组明显增高，A组的P21蛋白、凋亡蛋白caspase3表达水平较B组明显降低。结论：Ciglitazone能抑制肝癌HepG2细胞的恶性增殖的机制与PPARγ干预细胞周期和细胞凋亡有关。本课题提出以下新见解1．过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)在肝癌细胞中高度表达，可作为肝癌治疗的一个靶点。2．Ciglitazone可抑制肝癌细胞生长，并诱导其发生凋亡，且呈明显的时间及剂量依赖性。3．Ciglitazone可抑制肝癌细胞增殖，诱导其发生凋亡的机理与细胞周期蛋白和caspase3的活性改变有关。4．抑制NF-κB活性能增加肝癌细胞HepG2对ciglitazone的敏感性。5．Ciglitazone对肝癌的生长具有抑制作用，抗肿瘤血管形成可能是其中的作用机理之一。