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干细胞是机体各种组织细胞的最初来源，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，目前，已广泛用于组织工程学中培育新的组织和器官。牙髓组织是一种胚胎性的疏松结缔组织，富含成体干细胞。2000年，Groynthos等从人第三磨牙牙髓分离出具有克隆源性的多潜能细胞，称为恒牙牙髓干细胞DPSCs(dentalpulp stem cells，简称DPSCs)<[1]>。2003年，NIH施松涛教授发现儿童脱落乳牙的牙髓内也含有具有多向分化潜能的干细胞，命名为脱落乳牙干细胞SHEDs(stem cells from human exfoliated decidUOUS teeth，简称SHEDs)<[2]>。
以往的研究表明，牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞在体内具有不同的成骨功能<[3，4]>。将DPSCs与HA/TCP共同植入裸鼠皮下，6周后在HA/TCP的表面，可形成牙本质一牙髓复合体类似结构，牙本质特异性蛋白DSPP及骨涎蛋白、骨钙蛋白表达阳性。将SHEDs与HA/TCP共同植入裸鼠皮下，则形成较多的骨组织及少量的牙本质结构<[1，2]>。另有研究表明<[5，6，7]>：体外诱导DPSCs可向骨组织分化，将DPSCs植入到免疫抑制大鼠皮下，可以形成具有血供的类似于人的骨组织结构。目前，SHEDs和DPSCs在体内成骨的功能尚不清楚。由于SHEDs和DPSCs在体外培养中具有较高的克隆形成能力及增殖速度，因此它们可能成为骨组织工程中的种子细胞。
本研究旨在利用与人体相近的大型动物小型猪研究SHEDs和DPSCs在体内成骨功能及其条件。分为以下三个部分：
1．DPSCs和SHEDs生物学特性的研究取5～6月龄的小型猪下颌第一和第二乳切牙及12～13月龄小型猪下颌第一和第二恒切牙牙髓组织，用酶消化法和组织块法体外培养SHEDs和DPSCs。DPSCs在体外可传代至20代，连续培养时间180天，细胞状态良好。SHEDs在第6代后增殖速度明显下降，体外生长约至7～8代，连续培养时间80天。两者有明显区别。第三代SHEDs和DPSCs细胞倍增时间分别为4.2天和4.8天，SHEDs生长速度略快。25 cm<2>的细胞培养瓶中接种2000个细胞，SHEDs克隆集落形成率为13/2000个细胞，DPSCs克隆集落形成率为7/2000个细胞。免疫荧光染色检测细胞生物学特性，SHEDs和DPSCs均表达间充质来源细胞的典型蛋白Vimentin，且1/5左右的细胞表达基质祖细胞较特异性的标志物Stro-1。与骨髓间充质干细胞不同的是SHEDs和DPSCs均表达神经干细胞特异性标志nestin和神经元发育早期的标志β-tubulin Ⅲ。
2．SHEDs和DPSCs的体外诱导分化分别取第3代小型猪DPSCs和SHEDs，体外向骨组织、脂肪组织及神经组织诱导分化。DPSCs和SHEDs在含有15﹪胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周，Yon-kossa染色呈现高密度黑色阳性反应区域，ALP表达明显。经IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松诱导3周后，DPSCs和SHEDs均可分化为脂肪细胞，经油红染色可见橙红色阳性颗粒。挑选单克隆Stro-1阳性的SHEDs和DPSCs扩增后向神经细胞诱导分化，诱导后免疫荧光鉴定β-tubulin Ⅲ表达阳性， Stro-1表达阴性。体外培养的DPSCs和SHEDs均具有多向分化潜能，诱导分化情况无明显差别。
3．SHEDs和DPSCs与生物材料复合对小型猪下颌骨缺损修复的研究将标记有绿色荧光蛋白的SHEDs和DPSCs体外与磷酸三钙复合，扫描电镜观察细胞生长状况，然后回植到小型猪下颌骨骨缺损模型(大缺损2.5×1.5×1.5cm<3>和小缺损0.5×1.0×1.0cm<3>)上，观察其骨修复功能及其在体内转归。在16只小型猪下颌骨上制备左右对称的16个小缺损和单侧的8个大缺损，随机分为4组手术回植：实验组1：SHEDs+β-FCP组；实验组2：DPSCs+β-TCP组；对照组：单纯β-TCP组；空白对照组：骨缺损处无细胞，无材料。术后2周、4周、3个月、6个月，将小型猪分批按实验计划处死，进行荧光检查、影像学检查、宏观测量及组织学检查。荧光显微镜示，大量的乳牙牙髓干细胞已分化为骨细胞，被包埋在骨基质中，具有骨小梁结构，部分乳牙牙髓干细胞长入材料间隙。术后6个月大体观察及CT显示，SHEDs+β-TCP组下颌骨明显肥大，成骨功能最强。DPSCs+β-TCP组下颌骨也有较强的修复，组织学检查未见牙髓一牙本质样结构形成。单纯β-FCP有部分纤维组织修复骨组织，在空白对照组，可见下颌骨仍留有较大缺损。
总之：体外培养SHEDs和DPSCs，证实了本研究中培养的牙髓干细胞确实具有多样性分化潜能。DPSCs在体外生长周期较SHEDs长。回植到小型猪下颌骨骨缺损模型上骨修复的研究表明：SHEDs具有较强的成骨功能，DPSCs在小型猪骨组织环境中也具有一定的成骨功能，未见牙髓一牙本质样结构形成。