RecQ家族解旋酶属于SF2解旋酶超家族，对基因组稳定性的维持起着非常重要的作用。Bloom综合症、Werner综合症和Rothmund-Thomson综合症分别是由人类RecQ解旋酶3个成员BLM、WRN和RecQ4的功能缺失导致的，表现为多种严重的癌症症状。RecQ解旋酶解旋机制的大量研究，将为RecQ解旋酶作为抗癌药物靶的研究提供全新的思路。RecQ5解旋酶是人类5种RecQ家族解旋酶中的一员，人体细胞内RecQ5至少存在3种异构体RecQ5α、RecQ5β和RecQ5γ。RecQ5β全长包含991个氨基酸，包括解旋酶结构域和一个RQC结构域，还含有一个较长的与其它RecQ解旋酶没有同源性的C-末端区域。RecQ5β不仅能够解旋双链DNA结构，而且具有介导两条互补单链DNA分子退火的活性。尽管人们对解旋酶的研究已经比较广泛，但是目前RecQ5的生化特性及其在生物体内的功能仍不清楚。BLM全长1417个氨基酸，在溶液中能够以多聚体的结构存在，但是其解旋机制有待进一步研究。本研究对于深入了解RecQ家族解旋酶的作用机制，探索其生物学功能具有重要意义。本研究结合快速反应停流技术（stopped-flow method）和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的方法，系统的研究了RecQ5β的DNA退火和解旋动力学特性以及BLM的解旋活性。主要取得以下结果：1．在空状态和0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下，分析了随RecQ5β解旋酶浓度变化的RecQ5β对2nM两条互补的45-nt单链DNA底物的退火动力学过程。并对所有的退火动力学曲线进行双指数或三指数拟和，得到在四种状态下随RecQ5β浓度变化的退火初始速率。结果表明：（1）RecQ5β在四种状态下催化的退火反应在1020nM之间都有一个最适解旋酶浓度。（2）在四种状态下的最大初始退火速率基本相同。这与以前的研究结果不同。以前的研究认为，ATPγS和ADP能够完全或者部分抑制RecQ5β的退火活性。（3）在空状态和有磷酸核苷因子ATPγS存在状态下，RecQ5β催化的退火效率有比较宽的浓度变化范围，而在磷酸核苷因子ADP存在状态下，RecQ5β催化的退火效率其浓度变化幅度比较小。另外，定义了一个RecQ5β能够催化高效的退火反应时的有效的RecQ5β解旋酶浓度范围，在空状态和有磷酸核苷因子AMPPNP、ATPγS和ADP存在四种状态下，这个浓度范围分别为：5.6-27.7nM、9.8-24.1nM、4.9-33.8nM和11.5-19.3nM。2．通过偏振荧光的测量，分析了空状态和在0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下，一定量的RecQ5β解旋酶依次连续滴定到8nM3’F20-nt单链DNA底物的稳态结合动力学过程。结果表明，在四种状态下，RecQ5β解旋酶浓度较低时，偏振值随着RecQ5β解旋酶浓度的升高而升高。随后，RecQ5β解旋酶浓度较高时，偏振值不再升高，达到饱和。由于偏振值的变化反应单链DNA底物被结合在其上的RecQ5β解旋酶分子覆盖的程度，所以在RecQ5β解旋酶浓度较低时，单链DNA底物仅部分被RecQ5β解旋酶所覆盖；而RecQ5β解旋酶浓度较高时，RecQ5β解旋酶几乎完全覆盖单链DNA底物。并且，结合前面退火动力学分析中给出的有效的RecQ5β解旋酶浓度范围，在四种状态下，RecQ5β能够催化高效的退火反应时，RecQ5β解旋酶覆盖单链DNA底物的程度分别为：39.4%22.8%（空状态）、37.3%14.0%（AMPPNP）、37.8%26.3%（ATP S）和49.1%9.9%（ADP）。因此，RecQ5β解旋酶覆盖单链DNA底物大约40%-50%时，RecQ5β解旋酶能够催化高效的退火反应，而无论磷酸核苷因子存在与否。3．通过测量偏振荧光的方法，分析了（空状态和在0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下）在不同磷酸核苷因子存在状态下，100nM RecQ5β从10nM3’F20-nt单链DNA底物上的解离动力学过程。在空状态和AMPPNP与ATPγS存在三种状态下，RecQ5β从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程相似，都由一个快过程和一个慢过程两个过程组成。在ADP存在状态下，RecQ5β从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程只有一个过程。对所有的解离动力学曲线进行单指数或双指数拟合，得到空状态和在AMPPNP和ATPγS存在三种状态下的慢过程的解离速率和在ADP存在状态下的解离速率。结果表明，在ATPγS存在状态下，RecQ5β与ssDNA底物结合的最为紧密；而在ADP状态下，RecQ5β与ssDNA底物的结合最弱。空状态和在AMPPNP存在状态下，RecQ5β和ssDNA底物的亲和力相似。4．采用非互补的F和H标记的ssDNA底物进行退火动力学的分析。发现空状态和在ATP S存在状态下，荧光信号的变化较以互补ssDNA为底物的反应显著减小。充分说明在本研究中荧光信号的变化不是由于在RecQ5的作用下一些ssDNA分子的简单聚集，而是由于dsDNA的形成而造成的。结果表明本研究方法能够真实的反映RecQ5催化的ssDNA退火的动力学特性。5．采用另一种反应缓冲液体系：20mM Tris-acetate，pH7.9，50mM KOAc，10mMMg（OAc）2，1mM DTT和50mg/ml BSA，分析RecQ5的退火动力学特性。发现ATP S能够抑制RecQ5催化的退火反应。结果表明本研究方法能够真实的反映ssDNA的退火过程。6．在空状态下，比较分析了RecQ5β的C-末端缺失解旋酶片段RecQ5β1-662的随解旋酶浓度变化的退火动力学过程、稳态DNA结合动力学过程和解离动力学过程。退火动力学结果表明，RecQ5β1-662的最大初始退火速率比RecQ5β解旋酶全长低很多，前者大约为3%s-1，后者大约为30%s-1，低大约一个数量级。同样，可以得到RecQ5β1-662的有效的解旋酶浓度范围为4.6-16.3nM。由稳态DNA结合动力学分析可以得到，在空状态下，RecQ5β1-662能够催化高效的退火反应时，RecQ5β1-662覆盖单链DNA底物的程度为52.9%23.3%。这个结果表明，同RecQ5β解旋酶全长一样，当RecQ5β1-662覆盖单链DNA底物大约一半时，RecQ5β1-662能够催化高效的退火反应。该有趣的现象是否也存在于RecQ家族解旋酶的其它成员中，值得将来进一步研究。解离动力学结果表明，同RecQ5β解旋酶全长一样，在空状态下，RecQ5β1-662从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程由一个快过程和一个慢过程两个过程组成。其中，慢过程的解离速率为0.450.04S-1，基本同RecQ5β解旋酶全长在空状态下慢过程的解离速率一样，为0.510.12s-1。因此，尽管RecQ5β解旋酶全长与RecQ5β1-662对单链DNA具有几乎相同的亲合性，但这两个解旋酶的退火效率却相差很大。表明RecQ5β的退火活性，并不仅仅简单的决定于其与单链DNA底物的结合能力，而由特定结构所决定的解旋酶的内在特性也是非常重要的决定因素。进一步阐明了RecQ5β的C-末端区域是其催化高效退火反应所必不可少的。7．选择RecQ5β1-467和RecQ5β1-662两个RecQ5β解旋酶片段，确定了RecQ5β解旋的单转换动力学实验条件：以2nM双链部分长度为16-bp、带有不同长度（10-50nt）3’-尾链的ss/dsDNA为底物，温度为37°C、蛋白诱捕试剂dT56的浓度为2μM、ATP的浓度为1.5mM、RecQ5β的浓度为100nM。另外，对于较长的解旋酶片段RecQ5β1-662，DNA trap的浓度为2μM。8．在上述确定的单转换动力学实验条件下，通过对RecQ5β解旋酶N-末端三个氨基酸片段：RecQ5β1-467、RecQ5β1-567和RecQ5β1-662随不同3’-尾链长度DNA底物解旋动力学特性的研究和比较发现，该三个RecQ5β解旋酶片段的解旋幅度和解旋速率随着DNA底物3’-尾链长度的增加而增加，RecQ5β1-467的最高解旋幅度达到73.5%，RecQ5β1-567可达57.6%，而RecQ5β1-662则低于35.5%。即随着解旋酶氨基酸片段长度的增加，解旋酶的最高解旋幅度依次降低。在DNA底物的3’-尾链长度较短时，基本上只有一个慢解旋过程，随着3’-尾链长度的增加，快过程的解旋幅度显著增加，即RecQ5β对双链DNA底物的解旋依赖于3’-尾链长度。表明RecQ5β在对双链DNA进行解旋时具有协同性，这与以往E.coli RecQ的解旋特性截然不同，在SF2解旋酶超家族中是有趣的发现。9．RecQ5β解旋酶的N-末端467个氨基酸足够介导RecQ5β的解旋活性，多余的氨基酸序列会抑制其解旋活性，RecQ5β解旋酶自身存在一定的活性调节机制。N-末端467个氨基酸包含一个完整的解旋功能结构域，这为RecQ5功能域的划分提供了重要的理论依据。10．通过解离动力学分析，发现BLM持续解旋能力较低的原因在于，在ADP·Pi和ADP状态下BLM从DNA底物上解离的速率非常大，分别为3.9和4.8s-1，因此很容易从核酸链上解离下来，从而不能持续高效的进行解旋。