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近几年的研究揭示,细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated geneA,CagA)是幽门螺杆菌(H.pylori)重要的毒力因子之一。进一步研究CagA蛋白的生物学功能及其参与H.pylori致病的机制,郑州大学公共卫生学院幽门螺杆菌研究组利用同源重组技术,构建了cagA基因敲除突变株(Hp27ΔcagA),通过比较遗传背景相同的野生株与突变株生物学特性差异以及利用蛋白质组学方法对其菌体蛋白表达差异的分析,筛选和鉴定出与cagA基因相关的H.pylori功能蛋白。其中超氧化物歧化酶(SOD)为突变株与野生株菌体表达差异蛋白之一。而SOD蛋白与CagA之间的关系尚未见报道。为了进一步研究SOD蛋白与CagA之间的关系,首先我们需要制备出SOD蛋白的多克隆抗体,以便进一步确证SOD蛋白在野生株和敲除株之间有差异。方法(1)自行设计引物,利用PCR技术扩增目的基因片段。(2)利用Taq聚合酶克隆的特性,将扩增的目的基因片段连接到pMD19-T载体上,并转化大肠杆菌(DH5a)。(3)使用NdeⅠ、XhoⅠ酶双切,将目的基因片段与pET30(a)连接,并转化大肠杆菌(BL21)。(4)诱导表达后,利用融合蛋白带有6个His标签的特性,使用Ni-NTA柱纯化目的蛋白。(5)将纯化出来的目的蛋白作为抗原,免疫兔子制备多克隆抗体血清。(6)ELISA法检测血清抗体效价。结果(1)以Hp27总DNA组为模板,扩增出了sod基因片段。(2)将PCR扩增产物纯化回收后,与pMD19-T载体连接、转化DH5a大肠杆菌,测序后表明成功构建了重组质粒pMD19-sod。(3)测序后表明成功构建了重组质粒pET30-sod。(4)IPTG诱导表达后,蛋白产物进行Ni-NTA亲和层析纯化,分离纯化到纯度较高的其C-端含有6个组氨酸标签的SOD蛋白。(5)ELISA检测血清抗体效价＞1:3200,表明成功制备出多克隆血清抗体。结论(1)首次由Hp27中克隆出sod基因片段。(2)对重组质粒pET30-sod进行诱导表达。研究了诱导时间、诱导剂浓度、等因素对之表达效率的影响,确定了适宜的诱导表达条件为:IPTG浓度0.1mmol/L,诱导时间4.5h。(3)可溶性分析结果表明,克隆表达的SOD融合蛋白主要为可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE检测,SOD融合蛋白表达量非常高。(4)将纯化好的SOD融合蛋白作为抗原,免疫兔子,能制备出效价很高的抗体血清,为下一步研究奠定了基础。