【摘 要】
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马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）主要侵染马铃薯和烟草等茄科作物。PVY是马铃薯上发生最广泛、危害最严重的病毒,严重危害马铃薯产量和品质,造成巨大的经济损失。明确PVY的株系类型对马铃薯PVY的早期检测和有效防控具有重要意义。种植无毒种薯是防治马铃薯病毒病最经济有效的方式,快速、灵敏、准确的病毒检测是保证种薯脱毒效果的关键。血清学检测具有操作简单、灵敏、快速及适于检测大量样品等优
【基金项目】
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国家自然科学基金重点国际（地区）合作研究项目（31720103912）；
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马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）主要侵染马铃薯和烟草等茄科作物。PVY是马铃薯上发生最广泛、危害最严重的病毒,严重危害马铃薯产量和品质,造成巨大的经济损失。明确PVY的株系类型对马铃薯PVY的早期检测和有效防控具有重要意义。种植无毒种薯是防治马铃薯病毒病最经济有效的方式,快速、灵敏、准确的病毒检测是保证种薯脱毒效果的关键。血清学检测具有操作简单、灵敏、快速及适于检测大量样品等优点,是检测和诊断植物病毒最主要的方法。目前广泛应用的PVY单克隆抗体漏检率较高,完善PVY的检测体系对马铃薯安全生产意义重大。本论文鉴定了黑龙江马铃薯PVY分离物KS4和KS7的株系,分析了中国PVY分离物的基因组特性,获得了能检测更多PVY分离物的抗体组合。主要结果如下:1.证明PVY分离物KS4和KS7分别属于N:O株系和NTN-b株系通过RT-PCR扩增、克隆获得分离物KS4和KS7（Gen Bank登录号分别为MK234698和MK234699）的基因组序列,利用重组分析程序包和最大似然法分别进行重组分析和系统发育分析。其开放阅读框均有9 186个核苷酸,编码3 061个氨基酸,分离物KS4的核苷酸和氨基酸序列均与PVY分离物Mb112一致率最高,分别为96.9%和98.4%;分离物KS7的核苷酸序列与PVY分离物12-94一致率最高,为97.4%,其氨基酸序列与PVY分离物SYR-II-Be1一致率最高,为97.8%。重组分析表明,分离物KS4和KS7均为N-605和Oz的重组体,其中KS4基因组5′-端2 392个核苷酸来自N-605,其余来自Oz;KS7基因组的第800-2 227个核苷酸和第5 637-8 950个核苷酸来自N-605,其余来自Oz。系统发育分析发现,分离物KS4被聚类到N:O株系,分离物KS7被聚类到NTN-b株系。2.明确了中国PVY分离物的株系组成和遗传特征对本文测定的及Genbank中注册的共75条中国PVY分离物进行了系统发育、重组和选择压等分析。系统发育分析表明,PVY分离物分成PVYNTN-NW（SYR-II型）、PVYNTN-NW（SYR-I型）、PVYNTN（NTN-b型）、PVYNTN（NTN-a型）、PVYE、PVYNA-N/NTN、PVYEu-N、PVYN-Wi（N:O型）、PVYN-Wi（N-Wi型）、PVYO和PVYC等11个株系。除PVYE和PVYC株系外,其余9个株系中都有中国分离物。ME162、guiyang、PVYzu、SD-G、WA-13和CN:JL-1:17等6个分离物的基因组中未检测到重组,其余69个分离物均存在明显重组。根据重组位点的不同,中国PVY可以分为11种重组类型,其中5种为新型重组类型,包括SD1、GF＿YL20、1104、PVY-CJ、FZ10、DF、9703-3和1116等8个分离物。选择压分析表明,中国PVY分离物的11个基因均处于负选择,其中核内含体b基因受到的选择压最大,PIPO受到的选择压最小。基因流分析表明,中国马铃薯PVY分离物与中国烟草PVY分离物之间基因交流频繁,而其它寄主的中国PVY分离物之间交流不频繁。3.制备了PVY抗体,获得了能检测更多PVY分离物的抗体组合通过比对本文测定的及Gen Bank中注册的共1533条PVY分离物CP的序列,发现PVY CP第2-14个氨基酸共有90种类型。选取其中6种具有代表性的序列,制备了多克隆抗体PAb-1、PAb-2、PAb-3、PAb-4、PAb-5和PAb-6。通过定点突变技术在PVYN605的侵染性克隆p Cam PVYN605-GFP中引入突变,获得了85个PVY突变体,可表达上述90种抗原决定簇类型的85种。间接ELISA结果表明,国际上普遍应用的单克隆抗体MAb1130能够识别55种类型,占64.71%,能够覆盖1433个分离物,占93.91%;PAb-3、PAb-5和PAb-6三种抗体的组合能够识别68种类型,占80.00%,覆盖1504个分离物,占98.56%,比MAb1130识别的抗原决定簇类型多15.29%,覆盖分离物的数量多4.65%。
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