结缔组织生长因子在PCPA抑制野百合碱诱导的大鼠肺内ECM重机制探讨

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肺动脉高压(PAH)是一种以肺血管构型重建为主要病理变化特征的疾病,表现为肺小血管增殖、重塑及原位血栓形成,发生过程是一个复杂的病理生理过程,其发病机制尚未完全明了。近年来关于5-HT在肺动脉高压中的作用机理备受关注。   5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是一种重要的血管舒缩因子,与肺动脉高压的发生机制之间存在密切的关系。研究表明:肺动脉高压患者血浆中5-HT浓度明显增加。5-HT通过5-羟色胺转运体(serotonin transporter,5-HTT)盼作用激活MAPK信号通路,即Ras-Raf-ERK信号转导途径促进转化生长因子(transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)的上调。   人类结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)由Bradham等于1991年首次在培养的人脐静脉内皮细胞中发现,它属于即刻早期基因CCN家族(包括Cyr61、Cef10和NOV),CTGF作为转化生长因子的下游调节因子,可通过TGF-β/smad信号通路被调控,CTGF的生物学作用主要有:①促进细胞增殖,合成胶原,有文献报道其在肺动脉高压的发病期促进肺动脉平滑肌细胞的增殖。CTGF可显著增加成纤维细胞中Ⅰ型胶原、整合素和纤连蛋白基因的转录,CTGF是TGF-β刺激平滑肌细胞增殖和生长过程中必需的介质。②介导细胞黏附。与连蛋白、层粘连蛋白或Ⅰ型胶原相比,CTGF介导成纤维细胞黏附具有不同特点。它诱导细胞持久生成更多丝状假足和片状假足,促进细胞伸展,并激活酪氨酸激酶,传递细胞黏附信号;还可促进细胞增殖;参与血管形成中内皮细胞迁移和损伤修复中肉芽组织生成。③诱导细胞凋亡。④促进血管形成。损伤修复和纤维化疾病常伴随ECM沉积和血管形成。   另外,在肺动脉高压大鼠模型中,肺组织的金属基质蛋白酶MMPs明显增加,资料表明CTGF可提高部分金属基质蛋白酶的水平,尤其以胶原酶-13(matrixmetalloproteinases-13,MMP-13)更为显著,导致ECM的重构。在肺动脉高压发病机制中肺血管重构及右心肥厚的病理改变过程中,均涉及到肺血管平滑肌细胞过度增殖、凋亡抑制和ECM重构等机制。提示CTGF和MMPs及相关蛋白可能参与上述的病理过程。   同时,人骨肉瘤细胞研究表明:在正常机体内核转录因子-κB(nucleartranscription factor-κB,NF-κdB)与核转录因子-κB抑制蛋白-α相连,以失活形式存在于细胞质中。CTGF可通过整合素作用于IKK-NF-κB信号通路,使核转录因子-κB抑制蛋白-α发生磷酸化而解离,NF-κB激活后可产生大量的IL-1和IL-6等细胞因子,又可激活血管内皮细胞产生ICAM-1、ICAM-2等粘附分子及一氧化氮合酶(NOS)。以上炎症介质和细胞因子可激发机体全身炎症反应综合症发生。   本试验我们采用对氯苯丙氨酸(p-Chlorophenylalanine,PCPA)阻断5-HT的合成,PCPA是色胺酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase,TPH)抑制剂,而TPH是5-HT合成的限速酶,所以PCPA可阻断底物色氨酸合成5-HT。并且这种抑制是不可逆的,只能待胞体所合成的TPH运送到末梢,才能恢复合成的功能。   目前CTGF和IKK在野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型中的作用机制未见报道,同时PCPA抗肺动脉高压的作用是否与CTGF和IKK及相关蛋白有关也未见报道。因此本试验拟用MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型,对CTGF和IKK及相关蛋白表达水平及在药物PCPA干预的肺动脉高压作用机制进行相关研究,为PAH病情的治疗寻求新的突破。   实验材料与方法:   一、建立MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型   体重170±10g的雄性Wistar大鼠72只,随机分4组:对照组(control group)、野百合碱组(M group)、50mg·kg-1对氯苯丙氨酸低剂量预处理组(M+P1 group)和100mg·kg-1对氯苯丙氨酸高剂量预处理组(M+P2 group)。野百合碱组、对氯苯丙氨酸低剂量组和对氯苯丙氨酸高剂量组大鼠一次性腹腔内注射野百合碱60mg·kg-1;注射后,M+P1组和M+P2组大鼠每天分别腹腔内注射对氯苯丙氨酸50mg·kg-1和100mg·kg-1,C组和M组大鼠每天腹腔内注射等比例体积的生理盐水,给药三周。   二、大鼠肺血流动力学和右心室肥厚指数检测   三周以后,用3%戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,剥离左颈动脉,将充满肝素的PV-I聚乙烯导管连接压力换能器,测体循环压。同法将导管插入右颈静脉,经右颈静脉插入右心室,使其插入肺动脉,测量肺动脉压(多导生理记录仪,日本光电)。   将大鼠处死取出心脏,仔细分离右心室(right ventricle,RV)和左心室加室间隔(left ventricle and septum,LV+S),滤纸吸水后,分别称量RV和LV+S的重量。以右心指数(right ventricular index,RVI)作为右心肥厚的评价指标,公式如下:RVI-RV/LV+S×100%   三、肺HE染色和组织形态学检测   大鼠血流动力学指标检测后,用无菌盐水驱血、4%多聚甲醛固定。取大鼠肺下叶固定、石蜡包埋后切成5μm厚的切片,HE染色。在光学显微镜下对肺血管中膜厚度和肺血管壁面积进行测量分析。分别选择各组直径50~100μm的肺小动脉,测量血管外径、内径,用肺血管中膜厚度百分比评价血管的重构,公式如下:(Media wall thicknes(%)=external diameter-internal diameter/external diameter×100Wall area(%)=total vessel area-lumen area/total vessel area×100%)   四、检测肺组织、肺动脉胶原蛋白和弹性蛋白的表达   石蜡包埋的肺组织切成5μm厚的切片,维多利亚蓝染色。在光学显微镜下观察肺血管胶原蛋白和弹性蛋白的表达。   五、应用免疫组化检测肺动脉CTGF蛋白的表达   石蜡包埋的肺组织切成5μm厚的切片,参照SP法和DAB试剂盒使用说明书操作,不同的抗体抗原修复时间、抗体浓度选择不同。   六、应用Western Blot方法检测肺组织中CTGF、MMP-13的蛋白表达以及ERK、IKK蛋白及其磷酸化形式蛋白的表达   各组大鼠肺组织匀浆后,15000g、4℃离心30分钟,提取总蛋白,储存于-80℃;SDS-PAGE电泳:确定凝胶的体积和浓度,根据蛋白分子量配不同浓度的分离胶;转膜及封闭:用半干转转膜仪,根据分子量决定转膜时间;将PVDF膜放入封闭液中,4℃孵育过夜;抗体孵育;ECL显色;半定量分析。   采用统计分析的方法,分别比较以上不同组别之间各项指标的差异,探讨对氯苯丙氨酸对抗野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压机制。   七、应用Western Blot方法检测肺组织中细胞核和细胞浆NF-κBp65蛋白含量的变化   参照PP10-细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒使用说明书操作,分别提取浆蛋白和核蛋白,储存于-80℃;SDS-PAGE电泳:确定凝胶的体积和浓度,根据蛋白分子量配不同浓度的分离胶;转膜及封闭:用半干转转膜仪,根据分子量决定转膜时间;将PVDF膜放入封闭液中,4℃孵育过夜;抗体孵育;ECL显色;半定量分析。   采用统计分析的方法,分别比较以上不同组别之间各项指标的差异,探讨对氯苯丙氨酸对抗野百合碱诱导的大鼠肺内ECM重构的机制。   实验结果:   一、对氯苯丙氨酸抑制野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉压和右心室肥厚   成功建立慢性炎性肺动脉高压大鼠模型。与对照组比较,野百合碱组大鼠平均肺动脉压力显著升高,对氯苯丙氨酸高剂量组可显著降低野百合碱诱导的肺动脉压力。与对照组相比,野百合碱组大鼠右心肥厚指数明显增加,而对氯苯丙氨酸剂量依赖性地抑制了野百合碱诱导的右心室肥厚。   二、对氯苯丙氨酸剂量依赖性地抑制肺小动脉重构   野百合碱组肺小动脉血管壁厚度比对照组明显增厚。对氯苯丙氨酸剂量依赖性地抑制了肺小动脉血管壁增厚。野百合碱组肺小动脉血管壁面积与对照组相比明显增加。对氯苯丙氨酸剂量依赖性地减少肺小动脉血管壁面积。这表明对氯苯丙氨酸剂量依赖性地抑制野百合碱诱导的大鼠肺小动脉重构。   三、检测肺组织和肺动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的表达   应用维多利亚蓝染色法染色结果表明:在肺组织中,与对照组相比,MCT组血管壁弹性纤维和胶原纤维明显增多,且肺组织间隙也存在大量的弥散性胶原蛋白。MCT+P2组血管弹性纤维和胶原纤维明显减少。肺动脉中,与对照组相比,MCT组和MCT+P1组血管壁周围弹性蛋白变化不明显,但MCT组肺动脉间大量弥漫性胶原蛋白。MCT+P2组血管壁周围胶原蛋白明显减少。   四、对氯苯丙氨酸抑制肺组织CTGF和MMP-13蛋白表达   野百合碱组肺组织中的CTGF和MMP-13表达显著增加,对氯苯丙氨酸剂量依赖性地降低了野百合碱诱导的大鼠肺组织CTGF和MMP-13的过度表达。   五、对氯苯丙氨酸抑制肺组织ERK和IKK磷酸化蛋白含量的表达   野百合碱组肺组织中的ERK和IKK蛋白表达没有显著变化,但ERK和IKK磷酸化形式蛋白的表达明显增加,对氯苯丙氨酸剂量依赖性地降低了野百合碱诱导的大鼠肺组织中ERK和IKK磷酸化蛋白的过度表达。   六、免疫组织化学SP法检测肺动脉CTGF的表达   免疫组织化学研究结果表明,与Control组相比MCT组大鼠肺动脉CTGF表达水平增高,对氯苯丙氨酸剂量依赖性地降低了野百合碱诱导的大鼠肺动脉CTGF的阳性表达。   结论:   1.MCT诱导的PAH肺内ECM重构与CTGF激活IKK-NF-κB信号通路有关。   2.PCPA抑制野百合碱诱导的大鼠肺内ECM重构与抑制CTGF有关。   3.PCPA可通过对基质金属蛋白酶和IKK-NF-κB信号通路的抑制作用抑制肺内ECM重构。
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