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乳腺炎是影响奶牛养殖业的主要疾病之一,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是奶牛亚临床乳腺炎的主要病原菌。先天免疫系统是机体防御的重要组成部分。近年来的研究发现,自噬参与机体对病原菌的防御过程。硒作为机体必需的微量元素,在动物抗氧化、免疫和疾病的防治等方面发挥重要作用。因此,本试验以S.aureus感染牛巨噬细胞为模型,探究硒对S.aureus感染的牛巨噬细胞中自噬和炎症的影响。1.S.aureus对牛巨噬细胞自噬的影响。S.aureus(MOI=1:1)感染牛巨噬细胞0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h和4 h,采用western blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达量;激光共聚焦显微镜检测内源性LC3荧光聚点;透射电子显微镜观察S.aureus感染牛巨噬细胞后超微结构的变化;通过转染ptfLC3质粒检测S.aureus对牛巨噬细胞自噬流的影响。结果显示:S.aureus感染牛巨噬细胞1.5h、2.5h、3h和4h时,LC3-II表达量显著升高(p<0.05),并且在2h时,表达量极显著升高(p<0.01);p62的表达量在1.5h时,显著升高(p<0.05);在1 h和2h时,极显著升高(p<0.01);超微结构观察显示S.aureus感染牛巨噬细胞后,自噬囊泡增多;LC3内源性染色结果与western blot结果相一致,S.aureus感染牛巨噬细胞2h时,LC3荧光聚点明显增多;ptfLC3质粒转染结果表明,S.aureus感染牛巨噬细胞后,自噬流被阻滞。为研究干扰自噬后,S.aureus对牛巨噬细胞的影响,采用自噬不同阶段的调控剂进行干预,在S.aureus感染细胞2 h时,通过western blot检测LC3和p62的表达量;激光共聚焦显微镜检测内源性LC3荧光聚点;通过细菌载量检测细胞内S.aureus的载量。结果显示:与3-MA组相比,3-MA和S.aueeus共处理组,LC3表达显著增加(p<0.05),p62表达差异不显著(p>0.05);与CQ组相比,CQ和S.aureus共处理组,LC3 和 p62 表达均差异不显著(p>0.05);与 Rapamycin 组相比,Rapamycin和S.aureus共处理组,LC3和p62表达均极显著增加(p<0.01)。LC3内源性染色的结果与western blot结果一致。CQ处理细胞后,细胞内S.aureus的载量,随时间延长逐渐增加(p<0.05或p<0.01);Rapamycin处理细胞后,细胞内S.aureus的载量,随时间延长逐渐减少(p<0.05);3-MA处理细胞后,细胞内S.aureus载量随时间的变化,差异不显著(p>0.05)。结果表明,自噬体的积累有利于胞内菌的增殖。2.硒对S.aureus感染的牛巨噬细胞自噬的影响。用1μM、2 μM和4μM的亚硒酸钠预处理牛巨噬细胞12 h,然后S.aureus(MOI=1:1)感染牛巨噬细胞2 h,用western blot检测LC3和p62表达量;激光共聚焦显微镜检测内源性LC3荧光聚点;通过细菌载量检测硒对细胞内S.aureus载量的影响。结果显示:与S.aureus组相比,硒和S.aureus共处理组,LC3表达量差异不显著(p>0.05);随硒浓度的增加,p62表达量逐渐降低(p<0.05或p<0.01),并且在4μM的硒预处理时,极显著降低(p<0.01);LC3内源性的染色结果与western blot结果一致;并且4μM的硒极显著降低了细胞内S.aureus的载量(p<0.01)。以上结果表明,硒能够缓解S.aureus感染牛巨噬细胞引起的自噬流的阻滞,减少胞内菌的增殖。3.硒对S.aureus感染的牛巨噬细胞MAPK/NF-κB通路的影响。用western blot检测MAPK、NF-κB信号通路关键蛋白的表达;并在S.aureus感染牛巨噬细胞6h后,用荧光定量PCR检测相关炎性因子的表达。结果显示:S.aureus感染牛巨噬细胞后,ERK、JNK和p38的磷酸化水平极显著增加(p<0.01),4μM硒和S.aureus共处理组,显著降低了 ERK,p38的磷酸化水平(p<0.05),极显著降低了JNK的磷酸化水平(p<0.01);S.aureus感染显著增加了NF-κB的磷酸化水平(p<0.05),极显著增加了 IKBα的磷酸化水平(p<0.01),4μM硒和S.aureus共处理组,极显著降低了NF-κB的磷酸化水平(p<0.01),显著降低了IKBα的磷酸化水平(p<0.05);并且4μM的硒极显著降低了S.aureus感染引起的牛巨噬细胞中IL-1β、IL-6和IL-8的表达(p<0.01)。以上结果表明,硒能够抑制S.aureus感染牛巨噬细胞引起的MAPK和NF-κB通路的激活,抑制相关蛋白的磷酸化,降低炎性因子的表达。