论文部分内容阅读
目的:应用一系列生物细胞技术检测方法研究人参皂苷对氯化钴诱导H9c2细胞缺氧损伤的保护作用,分别从线粒体膜电位、氧化应激、有氧呼吸、ATP、NAD+、SIRT1/PGC1α、糖摄取和线粒体生物发生几方面证实人参皂苷的作用。探讨SIRT1在人参皂苷耐缺氧的靶向调节,为找出人参皂苷耐缺氧的物质基础,阐述人参保护心脏功效机制及产品研发提供了实验依据。方法:首先对人参皂苷所含皂苷进行定性和定量分析,先利用紫外-可见分光光度法对人参皂苷的总皂苷含量进行测定,再用HPLC对人参皂苷单体的含量和种类进行测定和计算,最后用LC-MS对人参皂苷进行定性分析。其次,建立氯化钴诱导H9c2细胞的体外缺氧模型:利用JC-1检测线粒体膜电位,DCFH-DA检测活性氧筛选氯化钴作用时间及浓度。然后对人参皂苷的治疗效果进行检测:将细胞随机分为对照（Ctrl）组,模型（CoCl2）组和治疗（GS）组,用流式细胞仪检测MMP、ROS、糖摄取和线粒体生物发生,Cytation 5检测OCR、ECAR、ATP和NAD+/NADH,WesternBlot检测SIRT1和PGC1α蛋白。接下来利用靶向调节剂烟酰胺（Nicotinamide,NAM,SIRT1抑制剂）验证人参皂苷耐缺氧作用机制:将细胞随机分为对照（Ctrl）组,模型（CoCl2）组、治疗（GS）组和抑制剂（NAM）组,依然用流式细胞仪检测MMP、ROS、糖摄取和线粒体生物发生,Cytation 5检测OCR、ECAR、ATP和NAD+/NADH,WesternBlot检测SIRT1和PGC1α蛋白。最后为了找出人参皂苷作用的物质基础:按照检测皂苷的含量百分比干预缺氧将细胞随机分为对照（Ctrl）组,模型（CoCl2）组和治疗（GS/皂苷单体）组,用流式细胞仪检测MMP。结果:（1）GS的人参总皂苷含量为81.76%,皂苷单体Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rk3、Rg3、Rg3（R）、PPT、Rk1、Rg5和Rh2含量分别为11.23%,18.32%、4.37%、5.96%、10.34%、1.40%、3.15%、0.57%、0.22%、7.42%、2.83%、6.30%、2.46%、1.00%、0.16%、1.73%、2.31%和1.68%。（2）氯化钴使H9c2细胞线粒体膜电位降低,活性氧升高,选择800μM、12h氯化钴为合适的造模条件。（3）与Ctrl组比较,CoCl2显著升高细胞ROS和ECAR水平,而GS会使之降低;与Ctrl组比较,CoCl2显著降低细胞MMP、糖摄取、线粒体生物发生水平、OCR、ATP、NAD+/NADH,SIRT1和PGC1α蛋白,而GS会使之升高。（4）与Ctrl组比较,CoCl2显著升高细胞ROS和ECAR水平,而GS会使之降低,NAM又使之升高;与Ctrl组比较,CoCl2显著降低细胞MMP、糖摄取、线粒体生物发生水平、OCR、ATP、NAD+/NADH,SIRT1和PGC1α蛋白,而GS会使之升高,NAM又使之降低。（5）与Ctrl组比较,CoCl2显著降低细胞MMP,GS、Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和Rb2会使之升高。结论:人参皂苷对氯化钴诱导的H9c2细胞损伤具有良好的的保护作用,SIRT1/PGC1α信号通路在这个过程中发挥了重要的调控作用,其中的Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和Rb2可能是其耐缺氧作用的物质基础。