胞内劳森菌和猪痢疾短螺旋体是两种常见猪的肠道病原体,在世界范围内广泛存在,造成养猪业巨大的经济损失。艰难梭菌是人畜共患病病原之一。近年来在猪场中发现致病性艰难梭菌的次数不断增加,艰难梭菌对食品安全的威胁也随之增加。开发胞内劳森菌、艰难梭菌和猪痢疾短螺旋体的快速检测方法有利于提高养猪业的经济效益、保障食品安全和人类健康。猪粪便样本比猪的血液和组织样本容易获取,不会对猪造成应激反应,可以活体采样,更加适合肠道病原体的检测。胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌可以随着粪便排出体外,从粪便中检测细菌核酸可以用来确诊猪是否被这三种病原感染,本研究的研究目的是建立一种同时检测猪粪便中胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌的多重PCR检测方法。本研究,摸索了胞内劳森菌的培养方法并且成功地将胞内劳森菌培养到第四代,完成了猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌的复壮,提取了这三种病原足量的基因组用于建立胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌多重PCR检测方法。本研究在猪粪便中克隆得到完整的胞内劳森菌16S rRNA序列,在分子水平证明了猪场存在胞内劳森菌感染,同时将粪便样本用于验证胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌多重PCR检测方法。建立胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌多重PCR检测方法过程为:首先,选择胞内劳森菌天冬氨酸脱氨酶作为胞内劳森菌的目的基因,利用生物信息技术,筛选出猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌基因组中保守并且特异的基因片段作为目的基因。其次,设计针对目的基因的特异性引物。然后,优化反应体系各种组成成分,调整反应程序,使其达到最佳检测效果。该方法特异性试验显示,只对胞内劳森菌、猪痢疾螺旋体和艰难梭菌产生了特异性条带,该方法的最低检测限度为胞内劳森菌DNA2.6 pg/μL,猪痢疾螺旋体4 pg/μL、艰难梭菌1.2 pg/μL。本研究工作主要分为三部分:1、胞劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌的培养以及鉴定。2、本研究首次建立了一种同时检测猪粪便中胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌的多重PCP方法,该方法操作简单、省时、省力,成本低。适用于猪场胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌感染的诊断,为胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌感染的监测和流行病学调查以及进一步研究和防治胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌引起的相关猪的疾病提供了参考方法。定。3、从猪粪便样本中克隆到胞内劳森菌16S rRNA序列并进行分析。