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铜对于许多细胞功能具有重要的作用。但是,过量的铜具有神经毒性,与临床典型的病例如肝豆状核变性(又称为Wilson’ s disease,WD)的病理机制有关。肝豆状核变性是一种常染色体隐性遗传疾病,由于体内缺乏铜运输ATP酶(ATP 7B突变)使铜通过胆道的排泄受阻。铜在肝脏内过度积累导致肝细胞坏死,最终释放入血管。过量的铜在脑内首先积累在基底节和脑皮质,导致神经元和星形胶质细胞变性。尽管铜的毒性机制还不完全了解,氧化应激已被认为是一个重要因素。用过量的铜处理人类胶质细胞的研究中发现了过氧化氢水平的增加。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种胶质细胞。除起到支持和保护神经元作用外,参与神经元微环境稳态的维持,并且在促进突触形成、维护突触正常功能,调控神经元信息、调节免疫功能中均起作用。与很多神经系统疾病有关,因此,星形胶质细胞已成为近年来关注的焦点。
目的:观察过量浓度Cu2+对原代培养的新生大鼠星形胶质细胞存活影响及探讨引起星形胶质细胞抗氧化功能损伤的可能机制。
方法:体外原代培养新生大鼠星形胶质细胞,并用免疫细胞化学法鉴定(神经胶质纤维酸性蛋白阳性)。将细胞分为低浓度氯化铜(CuCl2)组(30umol/L)、高浓度氯化铜组(100 umol/L)和对照组(无处理组),分别作用12、24、48、96、120小时后,用CCK-8法检测星形胶质细胞的存活率,用流式细胞仪测定星形胶质细胞凋亡及坏死比率。比色法测定星形胶质细胞内还原型谷胱甘肽含量及谷胱甘肽还原酶的活性,Griess反应法测定NO分泌量。Western bolt 法测定星形胶质细胞内核转录因子-KappaB(NF-kB)p65蛋白的表达。
结果:⑴低浓度CuCl2(30umol/L)引起星形胶质细胞的增殖(p<0.05),而高浓度(100 umol/L)组的存活率显著降低(p<0.01),随着高浓度CuCl2培养时间的延长,星形胶质细胞发生早期凋亡的比率明显增加。⑵高浓度CuCl2(100umol/L)作用24小时后细胞内GSH含量及GR活性显著低于对照组(p<0.01)。⑶与对照组比较,高浓度CuCl2(100umol/L)作用星形胶质细胞120小时,细胞分泌NO量显著增加(p<0.05)。⑷用100umol/L CuCl2培育星形胶质细胞,在24小时,NF-kB p65表达水平较对照组显著增加(p<0.05)。
结论:高浓度Cu2+显著损害星形胶质细胞的生长和增殖能力,能降低GR活性和GSH含量、增加NO分泌、活化NF-kB,从而加剧氧化应激,激活炎症途径,影响胶质细胞的存活和氧化防御等功能。在病理情况下过度负荷Cu2+对于星形胶质细胞具有毒性损伤作用,但损伤以早期细胞凋亡为主。提示尽早对疾病进行干预治疗可能减缓或阻止星形胶质细胞的损伤,为临床治疗提供新的治疗分子靶点。