家蚕伴性赤蚁(sex-linked chocolate, sch)是赤蚁突变品种之一,其性状表现为蚁蚕体色和头部呈现红棕色,而蜕皮后体色与正常无明显区别。该性状为单一基因控制的隐性性状,位于家蚕性染色z上的21.5座位；同时伴性赤蚁胚胎后期具有温敏致死性,因此,家蚕育种学家利用这两个特性将sch培育成了单养雄蚕的生产品种。单养雄蚕可以大大降低生产成本,同时可以获得更加优质的蚕丝,生产高品质蚕丝制品。前期研究已经克隆了sch的体色突变基因BmTh,该基因与温敏致死的关系目前还不是很明确,因此,本研究对伴性赤蚁的温敏致死机理开展了以下的研究,并获得了相应的结果：1、家蚕伴性赤蚁胚胎期温敏致死性状调查本研究从Dz和sch胚胎发育第五天至第八天每天都进行不同温度(25℃、30℃和35℃)和不同时间(1h、3h、16h、24h、36h、50h)的处理,处理完成后将蚕卵放入25℃中正常催青待孵化后统计孵化率。实验结果显示：对胚胎发育第五天的蚕卵进行高温处理,两个品种的孵化率与高温处理时间没有相关性；对胚胎发育第六天的蚕卵进行高温处理,当35℃处理36h之前,孵化率并没有明显变化,但是处理36h后sch孵化率开始呈现降低的趋势,处理50h后sch的孵化率有明显降低,降低至1.75%,而Dz在相同条件10处理其孵化率并没有明显变化,我们认为sch在胚胎发育六天后,进行高温(35℃)处理36h-50h这个时间段以内胚胎对温度的升高比较敏感。2、不同温度条件处理下家蚕伴性赤蚁突变BmTh基因表达量和多巴含量检测及BmTh酶抑制剂处理后表型观察本研究对不同温度条件处理的家蚕伴性赤蚁BmTh基因的表达量进行检测。胚胎发育至“C”型胚时,对sch和Dz胚胎在25℃常温和35℃高温条件下分别处理24h和48h。RT-PCR和荧光定量结果显示：Dz胚胎内的BmTh基因的表达量随着温度的升高、处理时间的延长而增加；而sch胚胎中,高温处理24h,BmTh基因的表达量随着温度的升高有明显增加,但是高温条件下处理48h后sch中BmTh的表达量却比常温下sch的表达量更低。另外,我们还对sch和Dz发育至点青期的蚕卵进行不同温度(25℃、30℃、35℃)处理16h,检测BmTh酶下游产物多巴的含量,发现两个品种中多巴的含量均随着处理温度的不断升高而逐步降低,但是sch蚕卵在多个温度条件下,多巴含量总是低于Dz。对Dz.sch蚁蚕中多巴含量进行检测显示,Dz蚁蚕中多巴的含量比sch蚁蚕多巴的含量要高。Dz添食TH酶抑制剂(3-IT)使其活性受到抑制,添加抑制剂的Dz二龄起蚕头部和体色呈白色,半月纹颜色与正常相比呈浅棕色,添加抑制剂的实验组存活率比对照组明显降低,并且随着抑制剂浓度越高和处理温度越高,存活率越低。3.Dz.sch胚胎不同温度处理后的转录组测序及分析已经清楚sch胚胎高温致死的敏感时期,我们选择胚胎发育至“C”型胚后高温处理48h对其进行转录组测序。洲序数据评估显示：测序的质量分布Q30值均高于82.3%；测的序列与基因组比对效率比较高,均在65%以上,其中uniquely mapped reads所占的比例均在97%以上；测序的cDNA分布均匀,测序饱和度也很好,多方面数据的评估均说明测序质量相当好,可用于后续转录组的分析,同时也暗示数据分析的可靠性。对相同品种不同温度间比较和相同温度不同品种间比较的差异基因进行了GO分类和COG分类,这些数据为我们提供大量的基础数据和信息,为后期深入分析奠定坚实的基础。比较Dz和sch两个品种高温(Dz-35℃vs Dz-25℃和sch-35℃vs sch-25℃)处理后的差异基因,其中两个品种分别高温处理后共有的差异基因为318个,仅存在于Dz或sch品种的差异基因分别为224个和242个；与Dz品种相比,sch品种常温和高温处理后(sch-25℃vs Dz-25℃和sch-35℃vs Dz-35℃)的差异基因分析,共有的差异基因为274个,仅为常温或高温处理组的差异基因分别为313个和210个。比较两个品种高温处理后共有的318个差异基因和sch品种高温处理后的210个共有差异基因,两者共有的差异基因有24个,其中最多的一类是表皮蛋白基因(9个),有趣的是,BGIBMGA012595基因都下调表达,推测其可能与sch高温致死相关。4、转录组代谢通路分析根据果蝇黑色素代谢通路中关键基因序列,将家蚕中的同源基因在常温和高温条件下产生的差异基因中比对。结果表明：在常温和高温条件下,sch品种中BmTh.yellow-d、GTPCH表达量与DZ相比存在明显差异,其中BmTh和yellow-d都下调表达,GTPCH上调表达。同时,我们还发现：35℃高温处理时,几丁质分解途径中关键酶几J‘质表达量上调2.04倍,但是该酶的表达量很低,因此这样的上调表达对几丁质的分解途径没有大的影响。高温条件处理下,Dz品种共有74个表皮蛋白差异基因,其中12个基因上调表达,62个基因下调表达；sch品种共有65个表皮差异基因,其中上调表达16个,下调表达49个。在这些差异基因中,共有19个基因注释为幼虫表皮蛋白的基因,其中Dz和sch品种分别为8个(2个上调表达,6个下调表达)和11个(4个上调表达,7个下调表达)。表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成部分。它不仅与几丁质以共价键的形式结合,同时表皮蛋白侧链还与色素类物质发生交联反应。表皮蛋白能与黑色素结合,对外骨骼的硬化起着重要作用,在高温情况下幼虫表皮蛋白基因下调表达的数量较多,高温下当表皮蛋白供应不足时,很可能会影响表皮的加固,与色素的结合作用,从而影响sch外骨骼和蚁蚕口器的正常硬化。