论文部分内容阅读
食源性致病菌是造成当今社会食品安全问题的重要因素,金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7是食品中常见的三种食源性致病菌,可导致人腹泻和呕吐,严重时甚至可致人死亡。常用食源性致病菌检测技术缺陷是检测周期长,设备和试剂昂贵且操作过程复杂,样品前处理复杂而繁琐。免疫磁珠分离(immunomagnetic separation,IMS)可快速分离致病菌,保护分离菌的生物活性,有效消除影响核酸扩增物质,提高检测的灵敏度,过程简单易用,无需昂贵的离心设备,是一种最具潜力浓缩和分离致病菌的前处理方法。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种适合基层检测特定致病菌的分子生物学方法,准确性高,检测时间短,对仪器设备要求低,适合快速检测致病菌。本研究把免疫磁珠富集方法和环介导等温扩增检测技术相结合,建立的致病菌IMS-LAMP快速检测方案,是一种简单,快速,高度特异性的基因检测技术,适用于食品污染领域的测试。研究结果如下:1.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的免疫磁珠富集方法的构建。分别将生物素标记的沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体与链霉亲和素纳米磁珠偶联,1 mg纳米磁珠偶联抗体量分别为10μg和6μg。沙门氏菌免疫磁珠、金黄色葡萄球菌免疫磁珠和大肠杆菌O157:H7的免疫磁珠富集条件优化,1 m L反应体系中免疫磁珠添加量分别为400μL、300μL和60μL,反应时间分别为45 min、30 min和30 min。三种致病菌的免疫磁珠特异性好,对5种非目标细菌未有捕获,灵敏度高,菌液浓度低至10~1 CFU/m L时仍有捕获。2.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法的建立。在LAMP反应液中添加荧光染料,建立实时荧光LAMP法。根据沙门氏菌的inv A基因,金黄色葡萄球菌的nuc基因和大肠杆菌O157:H7的rfb E基因的保守序列设计引物,进行引物筛选,选出最佳引物inv A-2、nuc-1和rfb E-1。对影响LAMP反应的温度进行优化实验,确定最优反应温度63℃。三种致病菌LAMP反应的特异性好,对5种非目标核酸无扩增反应。阴性重复结果好,在20次的阴性重复测试中均未发生扩增反应。精密度高,对10pg/μL和1 pg/μL浓度的目标质粒,LAMP法对沙门氏菌质粒的CV(Coefficient of Variance)值分别为3.58%和3.22%,对金黄色葡萄球菌质粒的CV值分别为3.65%和3.47%,对大肠杆菌O157:H7质粒的CV值分别3.40%和3.28%。灵敏度高,沙门氏菌质粒的灵敏度为1.91×10~2 copies/μL,金黄色葡萄球菌质粒的灵敏度为2.72×10~2 copies/μL,大肠杆菌O157:H7的质粒灵敏度为2.28×10~2 copies/μL,其灵敏度与对照的Real-time PCR检测灵敏度相同。检测不同浓度的纯培养菌液,鼠伤寒沙门氏菌灵敏度为3.0×10~2 CFU/m L,金黄色葡萄球菌灵敏度为1.1×10~2 CFU/m L,大肠杆菌O157:H7灵敏度1.75×10~3 CFU/m L。3.金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的IMS-LAMP检测方法的建立。IMS-LAMP法检测不同浓度的纯培养菌液,对鼠伤寒沙门氏菌菌液的最低检测浓度为3.0×10~2 CFU/m L,对金黄色葡萄球菌菌液的最低检测浓度为1.1×10~2 CFU/m L,对大肠杆菌O157:H7灵敏度为1.75×10~2CFU/m L。IMS-LAMP法与LAMP法检测人工污染牛肉样品,沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的IMS-LAMP法的灵敏度分别为1.2×10~3CFU/m L和7.0×10~3 CFU/m L,都比LAMP法高10倍。金黄色葡萄球菌的IMS-LAMP法的灵敏度与LAMP法相同,都为4.4×10~4 CFU/m L,但IMS-LAMP法检测4.4×10~3 CFU/m L浓度样品的阳性率为66.67%,LAMP法在相同浓度下未有检出。对于10~0 CFU/m L的低浓度样品进行增菌培养,IMS-LAMP法可比LAMP法提前至少2 h检测到扩增曲线。