前列腺癌是老年男性最常见的肿瘤,也是肿瘤中引起男性死亡三大原因之一,对于进展转移性前列腺癌患者来说,开始都对雄激素剥夺治疗敏感,但在经过治疗中位期为13-22月后,大多都会进展并转化为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。当患者进展至CRPC尤其是在经过一线二线药物治疗失败后,缺乏有效的治疗手段。由于中医药治疗疾病具有整体调节、辨证论治以及多靶点、多途径、多环节、多层次的特点并以其独特的疗效,在肿瘤治疗领域内广泛应用。前列消癥汤是治疗去势抵抗性前列腺癌的有效中药方剂,在中国中医科学院广安门医院泌尿外科临床应用10余年。在“积之成者,正气不足,而后邪气踞之”、“久病伤气”等中医理论的指导下,中国中西医结合泌尿外科奠基人刘猷枋教授通过不断的临床实践,运用宏观辨病和微观辨证相结合的思维方式,将去势抵抗性前列腺癌的核心病机概括为“正气不足、湿毒内蕴”,采用健脾益气生血、解毒散结利湿法组方前列消癥汤。该方由薏苡仁、黄精、黄芪、白花蛇舌草、莪术、土贝母、猪苓组成。方中以薏苡仁健脾渗湿为君药,臣以白花蛇舌草解毒软坚,伍以黄芪、黄精益气健脾养阴,伍以莪术、土贝母、猪苓解毒散结、化瘀止痛,诸药合用,共凑健脾益气生血、解毒散结利湿之功,体现了中医治疗晚期肿瘤的扶正祛邪这一基本中医治则。前期临床研究显示前列消癥汤能够改善患者生活质量,提高前列腺癌治疗功能评估(Functional assessment of cancer therapy-prostate,FACT-P)量表中生理状况评分、情感状况评分以及附加关注评分、减轻前列腺癌焦虑量表(memorial anxiety scale for prostate cancer,MAX-PC)量表中疾病相关的心理焦虑程度,改善患者排尿困难及尿急、尿痛、乏力症状,减缓前列腺特异性抗原(Prostate Special Antigen,PSA)倍增时间。前期基础研究显示前列消癔汤能够抑制雄激素非依赖性细胞系PC-3细胞的裸鼠移植瘤,前列消癥汤含药血清能够抑制PC-3细胞增殖,减弱PC-3的侵袭力,调节PI3/AKT信号通路中的关键蛋白作用。现为了进一步全面了解前列消癥汤对前列腺癌细胞系的作用,探讨健脾益气生血、解毒散结利湿法治疗去势抵抗性前列腺癌合理性及有效性,探索中药复方治疗肿瘤的效应机制,因此本实验选取激素非依赖性细胞系DU-145为研究对象,通过MTT实验研究前列消癥汤体外对前列腺癌DU-145细胞的增殖影响；并探索前列消癥汤体外对DU-145细胞的IC50；应用细胞划痕实验、平板克隆实验、Transwell实验研究前列消癥汤对DU-145细胞迁移和浸润能力的影响；通过流式细胞学技术研究前列消癥汤对DU-145细胞周期及凋亡的影响；通过RT-PCR、 Western Blot、免疫荧光技术研究前列消癥汤对DU-145细胞TGF-β通路及Wnt/β-catenin通路中关键蛋白基因的影响。目的：1、研究前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞的抑制增殖作用；2、研究前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞的浸润、迁移、增殖以及凋亡的影响；3、探索研究前列消癥汤抑制DU-145细胞增殖及诱导凋亡的作用可能是通过TGF-β通路及Wnt/β-catenin通路的交互作用的影响。方法：采用MTT实验检测前列消癥汤对DU-145细胞的抑制增殖情况并测定其IC50；通过细胞划痕实验、平板克隆实验、Transwell实验实验技术研究前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞的浸润、迁移的影响；将实验分为前列消癥汤高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组、正常组,通过流式细胞学技术研究不同剂量的前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞增殖以及凋亡的影响;通过Western Blot、RT-PCR、免疫荧光等手段检测前列消癥汤对DU-145细胞TGF-β通路中Smad3、α-SMA、Smad2、E-cadherin蛋白及基因的影响及Wnt/β-catenin通路中Wnt、β-catenin、Axin、SFRP-1蛋白基因的影响。结果：1、MTT实验中的最大剂量1920μg/ml药液用酸度计及冰点渗透压仪器测定三次,取平均值,结果显示PH值为6.912±0.074,参考DMEM/F12(加入NaHCO2)说明书,在正常范围6.6-7.2。渗透压为：285.673±5.057,在正常范围渗透压274—302mOsm/kgH2O内。MTT实验方法显示前列消癥汤能够抑制DU-145细胞增殖的,其IC50大约为830μg/ml。2、细胞划痕实验结果显示,各组细胞干预24h后迁移距离：高剂量组>中剂量组>低剂量组>对照组。前列消癥汤低剂量组与正常组细胞迁移距离相比,差异有统计学意义(P<0.05)；前列消瘛汤高剂量组细胞迁移距离较对照组比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)；前列消癥汤中剂量组细胞迁移距离较对照组比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。3、平板克隆实验结果显示：平板克隆实验结果表明：各组克隆形成率：高剂量组<中剂量组<低剂量组<对照组。前列消癥汤低剂量组与正常组细胞克隆形成率比较,差异无统计学意义(P>0.05)；前列消癥汤高剂量组细胞克隆形成率较对照组比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)；前列消癥汤中剂量组细胞克隆形成率较对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4、Transwell实验结果表明：各组迁移过膜细胞数：高剂量组<中剂量组<低剂量组<对照组。前列消癥汤低剂量组与正常组细胞迁移过膜数比较,差异无统计学意义(P>0.05)；前列消癥汤高剂量组细胞迁移过膜数较对照组比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)；前列消癥汤中剂量组细胞迁移过膜数较对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5、低剂量组早期凋亡、晚期凋亡与对照组比较,两者差异均没有统计学意义(P>0.05),中剂量组早期凋亡、晚期凋亡与对照组比较,两者差异均有统计学意义(P<0.05),中剂量组早期+晚期凋亡与对照组相比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01);高剂量组早期凋亡、晚期凋亡与对照组比较,两者差异均有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组早期+晚期凋亡与对照组相比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。6、细胞周期实验结果显示：对照组与低剂量组的S期细胞比例分别为(31.69±1.29)%、(31.51±2.61)%,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；对照组与中剂量组的S期细胞比例分别为(31.69±1.29)%、(37.96±2.24)%,两者差异有统计学意义(P<0.05)；对照组与高剂量组的S期细胞比例分别为(31.69±1.29)%、(43.77±2.48)%,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。7、RT-PCR结果：(1)低剂量组Smad3 mRNA相对表达量(RQ)较对照组的比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的Smad3 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05);阻滞剂组的Smad3 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的Smad3 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(2)低剂量组的a-SMA mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的a-SMA mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的a-SMA mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的a-SMA mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(3)低剂量组的Smad2 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的Smad2 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；阻滞剂组的Smad2 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的Smad2 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(4)低剂量组的E-cadherin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的E-cadherin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；阻滞剂组的E-cadherin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的E-cadherin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(5)低剂量组的Wnt mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的WntmRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的Wnt mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的Wnt mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)。(6)低剂量组的β-catenin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的β-catenin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的β-catenin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01);高剂量组的β-catenin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(7)低剂量组的Axin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的Axin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的Axin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的Axin mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(8)低剂量组的SFRP-1 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的SFRP-1 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；阻滞剂组的SFRP-1 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的SFRP-1 mRNA相对表达量较对照组比较,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。8、Western Blot结果：(1)低剂量组的Smad3蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05);中剂量组的Smad3蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的Smad3蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组的Smad3蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(2)低剂量组的a-SMA蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05);中剂量组的a-SMA蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的a-SMA蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的a-SMA蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(3)低剂量组的Smad2蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05);中剂量组的Smad2蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；阻滞剂组的Smad2蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的Smad2蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(4)低剂量组的E-cadherin蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05);中剂量组的E-cadherin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的E-cadherin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的E-cadherin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(5)低剂量组的Wnt蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的Wnt蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的Wnt蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组的Wnt蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(6)低剂量组的β-catenin蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的β-catenin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的β-catenin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)；高剂量组的β-catenin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。(7)低剂量组的Axin蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的Axin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的Axin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组的Axin蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)。(8)低剂量组的SFRP-1蛋白表达较对照组比较时,两者差异没有统计学意义(P>0.05)；中剂量组的SFRP-1蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；阻滞剂组的SFRP-1蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组的SFRP-1蛋白表达量较对照组比较时,两者差异有统计学意义(P<0.05)。创新点：应用分子生物学技术研究中药复方前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞系生物学行为的研究,验证健脾益气生血、解毒散结利湿法治疗去势抵抗性前列腺癌合理性；前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞增殖及诱导凋亡,可能机制是通过Wnt/p-catenin与TGF-β/Smad通路协调来实现,显示中医药治疗疾病的多靶点、多途径、多环节、多层次的特点,从细胞-基因-蛋白水平阐明了名老中医经验的科学内涵。结论：1、MTT实验方法显示前列消癥汤能够抑制DU-145细胞增殖的,其IC50大约为830gg/ml。2、划痕实验表明前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞的迁移能力,克隆形成实验表明前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞的克隆形成能力,Transwell侵袭实验表明前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞的侵袭能力,上述抑制效应均随着浓度的增加而增加。3、前列消癥汤能够诱导前列腺癌DU-145细胞的早期及晚期凋亡,并随着剂量的增加,促进凋亡的作用也随着增加。前列消癥汤使DU-145细胞在G0/G1期肿瘤细胞百分比下降,使S期肿瘤细胞百分比上升,G2/M期肿瘤细胞百分比不变,说明前列消癥汤主要抑制前列腺癌DU-145细胞从S期向G2期的转变。4、前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞的增殖,增加细胞凋亡,并增加E-cadherin以及Smad2表达、减少α-SMA及Smad3的表达,具有类似于TGF-β通路阻滞剂的效果。表明前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞的增殖,增加细胞凋亡可能是通过调节TGF-β通路介导的EMT来实现。5、前列消癥汤能够增加Axin以及SFRP-1表达、减少Wnt及β-catenin的表达,具有类似于Wnt/β-catenin通路阻滞剂的效果。可以看出前列消癥汤具有调控Wnt/β-catenin通路的作用。6、前列消癥汤能够抑制前列腺癌DU-145细胞增殖及诱导凋亡,可能机制是通过Wnt/β-catenin与TGF-β/Smad通路协调来实现。