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Micro RNAs是一类非编码RNA,在生物体内广泛表达,并且参与调控机体内细胞增殖,凋亡,周期等过程。课题组前期对产单羔和多羔的关中奶山羊卵巢进行高通量测序研究,筛选出产单羔山羊卵巢中差异高表达的mi R-486。生物信息分析表明,mi R-486可能参与调控奶山羊卵泡的生长与发育,影响卵泡闭锁的进程。奶山羊卵巢内卵泡的闭锁常伴随着卵泡壁层颗粒细胞的凋亡。然而,mi R-486调控奶山羊的卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的分子机制尚不清楚。本研究以关中奶山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,筛选出mi R-486的靶基因丝氨酸精氨酸富集的剪接因子3(SRSF3),通过构建SRSF3的过表达载体(pc-SRSF3)及合成SRSF3的干扰RNA(si-SRSF3)。利用CCK-8,Ed U,细胞流式,RT-q PCR,Western blot的方法,探究mi R-486及其靶基因SRSF3对奶山羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的调控作用。主要获得的研究结果如下:1.mi R-486抑制奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖,促进其凋亡通过RT-q PCR检测mi R-486在山羊卵巢,乳腺,子宫,垂体,肾,心,肺,肝,肠9个组织中的表达水平,结果显示,mi R-486在各组织中均有表达,其中肺的表达量最高,卵巢中也有较高表达。合成mimic NC,mi R-486 mimic,Inhibitor NC,mi R-486inhibitor,并将其转染至颗粒细胞。通过CCK8,Ed U,流式细胞法检测mi R-486对颗粒细胞的调控作用,结果表明,mi R-486显著抑制颗粒细胞的增殖,促进细胞凋亡。进一步通过RT-q PCR,Western blot检测发现mi R-486显著抑制细胞增殖相关通路蛋白PI3K、AKT和m TOR蛋白的磷酸化水平;此外,mi R-486显著促进凋亡相关基因BAX,P53,Caspase-3的表达,下调BCL-2的表达。以上结果表明,mi R-486通过PI3K/AKT/m TOR通路调控卵巢颗粒细胞的增殖,激活BAX,P53,Caspase-3及BCL-2的表达促进细胞凋亡。2.mi R-486靶向调控SRSF3的表达通过Targetscan预测发现SRSF3的3’UTR区包含mi R-486种子序列的靶位点,构建包含Xho I和Not I酶切位点的野生型和突变型双荧光素酶报告载体,在HEK293T细胞中验证mi R-486与SRSF3的靶向关系。结果显示,mi R-486显著抑制野生型载体的荧光素酶活性,而突变型载体的荧光素酶活性无显著变化。RT-q PCR,Western blot进一步检测发现mi R-486显著抑制颗粒细胞内SRSF3的表达。以上研究结果表明,mi R-486与SRSF3的3’UTR区的靶位点特异性结合,并且负调控SRSF3的表达。3.SRSF3促进奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡SRSF3在山羊卵巢,乳腺,子宫,垂体,肾,心,肺,肝,肠共9个组织中均有表达。其中子宫中的表达量最高,卵巢中的表达量次之,而在心、肺、肝、肠中的表达较低。通过NCBI预测山羊中SRSF3基因的CDS全长为495bp。构建包含Bam HI和Eco RI酶切位点的SRSF3 CDS全长序列的过表达载体pc-SRSF3以及合成SRSF3基因的干扰RNA,即si-SRSF3。RT-q PCR,Western blot检测结果显示pc-SRSF3显著促进颗粒细胞内SRSF3的表达,而si-SRSF3显著抑制颗粒细胞内SRSF3的表达。通过CCK8,Ed U,流式细胞法检测结果显示,pc-SRSF3显著促进颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡;而下调SRSF3的表达则促进细胞凋亡,抑制其增殖。此外,上调SRSF3的表达显著抑制BAX,P53,Caspase-3的表达,促进BCL-2的表达。而下调SRSF3的表达则结果相反。4.mi R-486靶向SRSF3调控奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡通过CCK8,Ed U,流式细胞法检测结果发现,与mi R-486 mimic相比,共mi R-486mimic和pc-SRSF3共转染组显著恢复了mi R-486 mimic对颗粒细胞活力的抑制作用,并且增加了Ed U阳性细胞的数目;此外,mi R-486 mimic与pc-SRSF3共转染抑制了mi R-486 mimic促进颗粒细胞凋亡的作用,降低了mi R-486诱导BAX,Caspase-3表达的上调作用,显著提高了BCL-2的表达和BCL-2/BAX的蛋白表达比率,但P53的表达几乎保持不变。尽管mi R-486 inhibitor和si-SRSF3共转染组结果与mi R-486 mimic和pc-SRSF3共转染组一致。但是,与mi R-486 inhibitor相比,mi R-486 inhibitor和si-SRSF3共转染组显著上调P53的表达。综上所述,mi R-486通过负调控靶基因SRSF3的表达促进颗粒细胞的凋亡,抑制颗粒细胞的活力与增殖,该结果为进一步探究mi R-486调控卵泡发育和闭锁的机制提供一定的试验依据。