论文部分内容阅读
研究背景:肺癌（lung cancer）是最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）是EGFR突变非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的首选治疗方案,然而几乎所有患者难逃耐药厄运。既往针对TKIs继发耐药的研究多聚焦于肿瘤自身,随着免疫治疗的快速发展,人们逐渐意识到肿瘤免疫微环境与肿瘤细胞间的相互作用亦可影响治疗进程。因此,研究肿瘤免疫微环境在肿瘤TKIs耐药中的作用机制势在必行。研究方法:利用R语言分析基于Gene Expression Omnibus（GEO）数据库的奥希替尼（Osimertinib）耐药前后EGFR L858R/T790M突变NSCLC细胞系H1975的RNA测序数据,利用 Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery（DAVID）进行GO和KEGG信号通路富集分析,利用Tumor IMmune Estimation Resource（TIMER2.0）进行信号通路、细胞因子及免疫细胞之间的相关性分析,利用Kaplan-Meier Plotter分析信号通路、细胞因子及免疫细胞与肺癌预后关系。构建携带人源EGFRL858R/T790M突变的稳转鼠源非小细胞肺癌细胞株,并利用该细胞株构建小鼠皮下移植瘤模型用于奥希替尼耐药相关研究。根据小鼠皮下肿瘤在奥希替尼治疗过程中肿瘤体积大小的变化,确定奥希替尼用药前,用药敏感,耐药三个时间点。利用流式细胞术（Flow cytometry）以及免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）研究上述三个时间点肿瘤免疫细胞浸润比例的变化,利用酶联免疫吸附测定实验（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）研究肿瘤及免疫细胞分泌细胞因子的变化,利用蛋白质免疫印迹实验（Western blotting,WB）研究肿瘤细胞信号通路的变化。肿瘤对奥希替尼耐药后,使用MAPK和NF-κB信号通路抑制剂联合治疗,观察肿瘤体积大小的变化,是否逆转耐药,然后使用流式细胞术,IHC,Elisa,WB方法研究此时的肿瘤免疫微环境。研究结果:对GEO数据库中奥希替尼耐药前后H1975细胞系的RNA测序数据分析发现,肿瘤细胞MAPK,NF-κB,TGF-β,VEGF信号通路在奥希替尼耐药后活化。进一步分析发现,上述四个信号通路与CD8+T细胞和CD4+T细胞数量正相关,与M2型肿瘤相关巨噬细胞（M2 type tumor associated macrophage,M2）,骨髓来源的免疫抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）,调节性 T 细胞（regulatory T cells,Tregs）数量负相关。细胞因子方面,上述信号通路与白介素1β（IL-1β）,白介素6（IL-6）,白介素10（IL-10）,白介素13（IL-13）,白介素34（IL-34）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）高表达正相关。动物实验发现,在奥希替尼治疗敏感阶段,肿瘤浸润的CD4+T细胞、CD8+T细胞、M1型种瘤相关巨噬细胞（M1 type tumor associated macrophage,M1）比例增多,耐药阶段减少;M2,MDSCs,Tregs比例在奥希替尼治疗敏感阶段减少,耐药阶段增多。信号通路方面,MAPK,NF-κB信号通路在奥希替尼耐药时活化,TGF-β,VEGF信号通路无明显变化。细胞因子方面,在奥希替尼耐药阶段arg1,IL4,IL10,IL34表达及分泌增多,γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）表达及分泌减少。同时抑制MAPK,NF-kB信号通路可使奥希替尼耐药后的小鼠皮下肿瘤体积缩小,单独抑制上述信号通路对肿瘤抑制作用无联合用药明显。另外,我们发现同时抑制MAPK,NF-κB信号通路后M2,MDSCs,Tregs 比例以及argl,IL-4,IL-10,IL34表达分泌减少,CD4+T细胞,CD8+T细胞,M1比例以及IFN-γ表达分泌增多,单独抑制上述信号通路这些免疫细胞及细胞因子无明显变化。研究结论:EGFR L858R/T790M突变的NSCLC在奥希替尼治疗敏感阶段肿瘤免疫微环境为激活状态,奥希替尼治疗耐药阶段肿瘤免疫微环境为抑制状态。奥希替尼耐药后肿瘤NF-κB和MAPK信号通路活化,并通过分泌免疫抑制细胞因子如IL-4,IL34招募免疫抑制细胞如M2,MDSCs,Tregs,减少免疫激活杀伤性细胞如CD4+T细胞,CD8+T细胞,M1的比例。免疫抑制性细胞分泌arg1,IL10抑制CD8+T细胞功能,减少IFN-γ的表达分泌,塑造免疫抑制肿瘤微环境,导致奥希替尼耐药。同时抑制NF-κB和MAPK信号通路可以通过减少免疫抑制细胞因子的表达及分泌,减少免疫抑制细胞的数量,使肿瘤免疫微环境再次激活从而逆转奥希替尼耐药。