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引言:结核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,TB)感染是人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染者常见的机会性感染,TB感染能加速HIV感染的疾病进程,是导致HIV患者死亡的主要原因。由于HIV/TB共感染者不具有TB单一感染者的典型临床症状体征、影像学表现特征和免疫学特征,传统检测方法检测灵敏度大幅降低或检测难度增加,往往导致漏诊、误诊,延误最佳治疗时机,从而引发患者死亡或者结核在群体中的传播。目的:通过负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4和PD-1抗体阻断逆转HIV感染者T淋巴细胞免疫抑制效应,以提高改良F-SPOT.TB对TB特异性抗原的免疫应答,进而增加HIV/TB共感染者中TB感染的检出率。方法:在2015年1月至2017年12月本院留存的HIV感染者血样标本且符合CD4~+T细胞<200个/ml的患者中,选取HIV/TB共感染、传统F-SPOT.TB检测阴性患者38例;HIV/TB共感染、传统F-SPOT.TB检测阳性患者14例;HIV单一感染、传统F-SPOT.TB检测阴性患者18例;同时选取该时期内HIV阴性健康人、传统F-SPOT.TB检测阴性12例。取各组患者或健康志愿者的冻存外周血单个核细胞(PBMC),进行免疫荧光标记和流式细胞术检测,分析负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1在各组CD4~+T细胞、CD8~+T细胞的表达水平;分析IFN-γ在各组别CD4~+T细胞和CD8~+T细胞不同亚群的表达。进而在传统F-SPOT.TB检测技术基础上,在每个样本的阻断孔中同时加入相应的负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1阻断性抗体,根据阻断孔斑点数有无显著增加来评价实验效果。流式细胞术结果用FlowJo软件制图和分析,实验所录数据用Microsoft Excel 2016进行计算并用单边分析法(ANOVA,SPSS v 11.5 for Windows)进行差异性分析,同组数据间置信区间为p<0.05,实验数据结果用Origin v 7.5 Professional软件进行制图。结果:(1)经免疫荧光标记和流式细胞术检测,证实了负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1在HIV/TB共感染患者外周血CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞表达上调。与HIV单一感染者和健康对照人群相比,无论是CD4~+T淋巴细胞还是CD8~+T淋巴细胞,LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1的表达均呈现HIV/TB共感染患者最高,其次为HIV单一感染者,最后为健康人(p<0.05)。(2)经免疫荧光标记和流式细胞术检测分析证实,与TIM-3~-CD4~+T淋巴细胞和TIM-3~-CD8~+T淋巴细胞以及PD-1~-CD4~+T淋巴细胞和PD-1~-CD8~+T淋巴细胞相比,IFN-γ在外周血TIM-3~+CD4~+T淋巴细胞和TIM-3~+CD8~+T淋巴细胞、在PD-1~+CD4~+T淋巴细胞和PD-1~+CD8~+T淋巴细胞的表达明显降低;IFN-γ~+CD4~+T细胞和IFN-γ~+CD8~+T细胞的表达在HIV/TB共感染患者明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)38例确诊HIV/TB共感染但F-SPOT.TB检测阴性患者,行改良F-SPOT.TB实验后,16例为阳性,22例仍为阴性,阳性率为42.1%,检出率显著提高(p<0.05)。14例确诊HIV/TB共感染、F-SPOT.TB检测阳性患者行改良F-SPOT.TB实验后,14例仍全部为阳性,阳性率为100%(无差异,p>0.05)。18例单纯HIV阳性、F-SPOT.TB检测阴性患者行改良F-SPOT.TB实验后18例阴性;12例HIV阴性、F-SPOT.TB检测阴性健康人行改良F-SPOT.TB检查后12例阴性。由此提示,该结果不存在假阳性和/或假阴性误判。结论:负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1在HIV/TB共感染患者外周血CD4~+和CD8~+T淋巴细胞表达上调;IFN-γ在外周血TIM-3~+CD4~+T淋巴细胞和TIM-3~+CD8~+T淋巴细胞、在PD-1~+CD4~+T淋巴细胞和PD-1~+CD8~+T淋巴细胞的表达明显降低;IFN-γ~+CD4~+T细胞和IFN-γ~+CD8~+T细胞的表达在HIV/TB共感染患者明显降低;38例传统F-SPOT.TB检测阴性HIV/TB共感染患者经改良F-SPOT.TB检测,阳性检出16例(阳性率42.1%),由此表明,加入4种负性共刺激分子LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1抗体阻断的改良F-SPOT.TB检测法可成功运用于HIV/TB共感染患者,以进一步提高晚期艾滋病患者(CD4~+T细胞<200个/ml)TB的检出率。