非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病,可感染不同品种及日龄的家猪和野猪,病死率高达100%,这给养猪业造成逾百亿的直接经济损失。由于ASF尚无有效的治疗方法和商品化疫苗,只能依靠快速诊断和扑杀等防控手段来控制该病的传播。目前针对ASFV的检测方法虽各有优势,但大多仍需要依赖大型实验室仪器设备和专业的操作人员,难于满足现场快速检测的需求,因此开发灵敏快速、操作简单、判读方便的ASFV检测方法对ASF的预防与控制具有重要意义。近些年来,存在于大多数细菌与所有古菌中的防御机制CRISPR/Cas系统逐渐走入人们视野,其中CRISPR/Cas12a因具核酸外切酶活性（切割靶标ds DNA后还可非特异性切割其他ss DNA）已成为病原核酸检测的研究热点。重组酶介导核酸扩增技术（RAA）是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒温条件（如37°C）下扩增DNA的方法,其不需要精密的热循环仪器,在恒温条件下就可完成目标核酸的指数扩增,在现场检测具有优势,扩增快且操作简单。本研究基于上述两种检测技术,通过将RAA与CRISPR/Cas12a的切割反应相结合,建立了无需昂贵仪器设备和专业操作人员的ASFV检测方法。具体研究结果如下:1.成功表达纯化了AsCas12a蛋白,并验证其具有切割活性。将p MBP-AsCas12a质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）后,在IPTG浓度为0.5 m M,温度为30°C,180r/min的诱导条件下2.5 h成功诱导出所需蛋白,并通过镍柱和MBP标签纯化柱纯化出了AsCas12a蛋白。2.成功构建阳性标准质粒及设计了针对ASFV并适用于Cas12a的g RNA。根据Gen Bank上公布的ASFV保守的B646L基因设计PCR引物,以合成完整的B646L序列为模板,构建PMD-19T-p72标准阳性质粒;在ASFV高度保守的B646L基因序列中,根据Cas12a所识别的PAM序列设计了g RNA,经检测验证了g RNA的可行性。3.根据相应靶点成功设计了RAA引物,等温扩增的结果表明引物可以扩增靶标序列并可以用于检测。4.成功建立了基于CRISPR/Cas12a的ASFV检测方法并进行了体系优化。结果显示所设计的两条g RNA中g RNA2效果相对较好,检测体系的Cas12a蛋白和g RNA最佳浓度分别为200 n M和150 n M,荧光检测反应30 min、试纸条检测反应20 min后孵育4 min均可得到可靠结果。5.对该检测方法的特异性、灵敏性以及重复性进行了评估,结果显示该方法特异性良好,与PCV2、PCV3、PRRSV、PRV、CSFV阳性样品均未无交叉反应,荧光检测与试纸条检测的检测下限均为10 copies/μL,同时该方法具有良好重复性,多批次检验不同拷贝数阳性样品后,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%。综上所述,本研究建立了一种可在恒温条件（37°C）下实现快速检测ASFV的方法,结果可通过蓝光照射或试纸条直接判读,具有良好的灵敏性与特异性,且操作简单、无需昂贵实验仪器设备及适用于临床检测,为ASFV的快速诊断及流行病学调查提供了切实可行的技术手段。