小鼠Rhox5为同源异型框基因，隶属于Rhox基因簇（reproductive homeobox on the X chromosome genes cluster）β亚簇。多项研究表明其在生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中发挥重要的作用，但如何发挥功能尚未清楚。鞘脂激活蛋白原（prosaposin）为一多功能蛋白，除参与脂类代谢、神经系统营养外，其亦在生殖系统的发育和前列腺癌的发生中担任重要角色。本人前期的酵母双杂交实验首次发现Rhox5蛋白能够与prosaposin相互结合，将都能够在雄性生殖系统中特异性表达的两种蛋白联系起来。由于前人的研究表明在前列腺癌中，prosapsin蛋白可以以PI3K／Akt依赖的模式促进细胞存活和抑制凋亡。基于此，我们提出这样的假设：Rhox5与prosaposin的结合可能通过PI3K／Akt信号传导通路参与雄性生殖系统中的发育、配子的形成过程中的调控机制。进一步研究小鼠Rhox5蛋白与prosaposin之间的相互作用，定位其相互作用的关键结构域；研究其相互作用模式，可能为阐明两者在雄性生殖系统的发育、配子的形成过程中的调控机制奠定理论基础。本研究主要结果如下：1．Rhox5的原核表达、抗体制备及其亚细胞定位分析成功地构建了pET22b-Rhox5原核表达质粒；针对Rhox5 cDNA序列中富含大肠杆菌稀有密码子且这些稀有密码子大多串联排列这一现象，创新性地采用修饰后的大肠杆菌菌株Rosetta ^TM2（DE3）为宿主细胞。该菌株含有独立表达7种大肠杆菌稀有密码子tRNA的质粒，有效的克服了由于密码子偏好性差异导致的外源基因低表达，从而实现了Rhox5-6His融合蛋白的高效表达。优化表达条件，在转接后OD600达到0.6-1.0时加入IPTG至终浓度为0.4 mM诱导1.5 h，Rhox5-6His融合蛋白的表达量达到菌体总蛋白的16％；Ni²⁺亲和纯化Rhox5-6His蛋白，并将纯化后的蛋白进行超滤除盐和冻干。免疫雄性新西兰兔，获得Rhox5蛋白特异性的多克隆抗血清，ELISA测定抗血清效价为1：160 000，Western blotting表明该多克隆抗血清能特异识别结合内源性的Rhox蛋白及外源性GFP-Rhox5蛋白。使用自制的Rhox5特异性多克隆抗血清，我们首次证实了内源性Rhox5蛋白的细胞核定位。由于Rhox5蛋白可能在胚胎发育、生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中起关键的调控作用，Rhox5蛋白及其特异性多克隆抗血清的获得将为Rhox5蛋白的功能性研究提供有效的工具。2．Rhox5可以直接与Prosaposin相互作用在前期酵母双杂交系统初筛中，我们获得了一个与Rhox5相作用的分子：No.1-14。双向酵母双杂交实验表明Rhox5蛋白与No.1-14在酵母体内存在相互作用。GST-pull down实验再次证实了Rhox5蛋白与No.1-14间的物理性相互作用。将No.1-14的核苷酸序列进行Blast，通过序列比对和搜索，获得一个与No.1-14序列100％同源的cDNA序列。该cDNA序列为prosaposin（Psap）基因，编码鞘脂激活蛋白原。No.1-14位于Prosapsin蛋白的C末端。PCR方法从小鼠7天胚胎cDNA文库中扩增全长的prosaposin的cDNA序列，获得了不含外显子8的prosaposin剪接本。双向酵母双杂交实验表明Rhox5蛋白与prosaposin（without exon8）在酵母体内存在相互作用。GST-pull down实验再次证实了Rhox5蛋白与prosaposin（without exon8）间的物理性相互作用。间接免疫荧光显示Rhox5蛋白与prosaposin共定位于细胞核中；哺乳动物细胞免疫共沉淀实验结果表明在胞内外源性的prosaposin蛋白不仅可以结合外源性的Rhox5蛋白，而且可以与细胞本身表达的Rhox5蛋白相结合。这些结果均表明Rhox5蛋白在胞内可以与prosaposin相结合，而其C末端的172个氨基酸残基可能在其结合中发挥重要作用。Rhox5／prosaposin间的相互作用可能是通过MAPK和PI3K／Akt信号通路调控小鼠雄性生殖系统的发生、精子的生成、成熟及前列腺癌的发生。然而，这些假设需要进一步的实验证据支持。3．Rhox5与Prosaposin相互作用的关键结构为进一步确定含有外显子8的prosaposin蛋白与Rhox5蛋白间的相互作用，重叠延伸PCR方法扩增获得含有外显子8的prosaposin cDNA序列，并将其克隆至酵母双杂交载体pGBKT7和pGADT7中，双向酵母双杂交和体外的GST-pull down实验均表明，含有外显子8的prosaposin蛋白和不外显子8的prosaposin蛋白同样可以结合Rhox5蛋白，其与Rhox5的亲和力相当，暗示prosaposin的这两种剪接本与Rhox5蛋白的结合均有可能具有生理学意义。研究与prosaposin结合的Rhox5关键结构，PCR方法分别扩增获得Rhox5的两个截短型片段，Rhox5 A和Rhox5 B。其中Rhox5 A为Rhox5蛋白N端的104个氨基酸残基，不含任何保守结构域，酵母双杂交和GST-pull down实验均表明该截短型片段不能与prosaposin蛋白结合；Rhox5 B为Rhox5蛋白C端的105个氨基酸残基，含有保守的homeodomain，酵母双杂交和GST-pull down实验表明该截短型片段不仅能与prosaposin蛋白结合，而且其结合力度与全长的Rhox5蛋白没有任何差异。提示Rhox5蛋白的同源异型域为其与prosaposin蛋白结合的关键结构。研究与Rhox5结合的prosaposin的关键结构，构建四种prosaposin的截短型片段：Psap A，包含了除No.1-14之外的氨基酸残基；No.1-14；saposin C，包含第313-392位氨基酸残基；saposin D，包含了第438-517位氨基酸残基。双向酵母双杂交和GST-pull down结果均表明prosaposin各截短型均可以与Rhox5结合，但结合力度存在差异：Prosaposin＞Psap A，No.1-14＞saposin C，D。生物信息学分析其3D结构模式图发现，除蛋白的肽链长度逐步减少，二硫键的数目减少外，其二级结构极其类似。为进一步确定影响prosaposin蛋白中与Rhox5蛋白结合的结构，构建两种saposin D的突变体：saposin D M3C和saposin D M6C，分别将saposin D内的3个／6个半胱氨酸突变成丝氨酸，以破坏其2个／3个保守的二硫键，并使氨基酸组成中疏水性氨基酸比例降低，试图破坏其疏水性的核心。双向酵母双杂交和GST-pull down结果表明saposin D M3C与Rhox5的结合力度与野生型的saposin D相当，而saposin D M6C则丧失了与Rhox5结合的力度。生物信息学分析其3D结构模式图发现，saposin D M3C的3D结构与野生型的saposin D类似，而saposin D M6C的3D结构与野生型的saposin D相比，其第3个α螺旋的长度明显减少，而第3、4个α螺旋间的环状结构长度延伸。这有可能是导致Saposin D M6C丧失了与Rhox5结合力的主要原因。4．Rhox5／Prosaposin的相互作用及其与PI3K／Akt信号通路为研究单独的Rhox5、prosaposin及Rhox5／prosaposin协同作用的生理功能，将哺乳动物细胞表达质粒pcDNA-Rhox5-HA和pcDNA-Psap-Myc单独或共同转染NIH3T3细胞，通过G418和潮霉素B筛选，RT-PCR和Western blotting实验的最终鉴定，获得阴性对照细胞株pcDNA3.1 in NIH3T3，单独过表达Rhox5-HA的细胞株Rhox5-HA in NIH3T3，单独过表达Psap-myc的细胞株Psap-myc in NIH3T3以及同时过表达Rhox5-HA和Psap-myc的细胞株Rhox5／Psap in NIH3T3。MTT实验检测四种细胞株的细胞增殖情况，结果发现过表达prosaposin可显著促进NIH3T3细胞的增殖；过表达Rhox5蛋白的细胞增殖略有增加；而当两者协同过表达后其促细胞增殖效果较单独的prosaposin处理有所下降。PI3K／Akt信号通路特异性抑制剂LY294002处理细胞后，能够显著改变由prosaposin及其与Rhox5蛋白的协同作用对细胞增殖的影响。无血清条件下诱导细胞凋亡，结果表明过表达prosaposin可显著抑制无血清诱导的NIH3T3细胞的凋亡；Rhox5的过表达对细胞的凋亡也起到了一定的抑制作用；然而当Rhox5／prosaposin协同作用后较单独的prosaposin作用下其抗凋亡效应显著降低。为进一步剖析Rhox5与prosaposin的单独作用及其协同作用对细胞增殖及细胞凋亡的影响，Western blotting实验检测四种细胞模型的PI3K／Akt信号通路中各蛋白的磷酸化水平改变。结果发现：单独过表达Rhox5，prosaposin及协同过表达Rhox5／prosaposin的细胞与阴性对照细胞相比Akt蛋白的总量、PTEN^Ser380、Akt^Thr308、Raf^Ser259的磷酸化水平均未见改变。Rhox5可微量提高PDK1^Ser241、Akt_Ser473、GSK3β^Ser9的磷酸化水平；prosaposin可显著提高这三个蛋白的磷酸化水平；而Rhox5和prosaposin协同作用后较prosaposin单独作用下三者的磷酸化水平有所降低。LY294002可抑制由Rhox5、prosaposin及两者的协同作用诱导的PI3K／Akt信号通路蛋白磷酸化水平的提高。Realtime PCR结果表明，Rhox5和prosaposin单独的过表达可抑制细胞周期抑制基因P27^KIP1的表达，促进细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，促使细胞周期从G1→S期进展；同时诱导survival基因cIAP1、cIAP2的表达，促进细胞存活。而两者协同作用后对细胞周期和细胞存活的调节较单独的prosaposin作用有所改变。本研究获得了Rhox5蛋白的高效表达，制备Rhox5特异性抗血清，证实了内源性Rhox5蛋白的细胞核定位。首次证实了prosaposin与Rhox5蛋白的相互作用，提出Rhox5蛋白的同源异型域及prosapoin肽键内部的二硫键在Rhox5／prosaposin结合中起关键作用。研究其相互作用模式，得出了推论：在病理条件下（前列腺增生、癌变或雄激素调控异常），可能导致两种均受雄激素调控的基因Rhox5和／或prosaposin的过表达。过表达的prosaposin被分泌至胞外，充当营养因子或细胞因子的功能，通过PI3K／Akt信号通路促进细胞增殖、抑制细胞凋亡；过表达的Rhox5可能通过Rhox5蛋白本身Ser和Thr的磷酸化或通过其下游调控分子活化PI3K／Akt信号通路，同样发挥促细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能；而当Rhox5和prosaposin同时过表达时，Rhox5蛋白则充当负调控的作用，抑制prosaposin的分泌，在某种程度上抑制由prosaposin诱导的PI3K／Akt信号通路的活化，进而改变由prosaposin诱导的细胞增殖和抗凋亡活性。本研究为prosaposin与Rhox5蛋白及其协同作用可能在前列腺及前列腺癌的发生、转移和入侵中发挥作用的机制研究奠定了基础。