癫痫(Epilepsy)是以大脑神经元过度放电为特征的中枢神经系统临床综合征,是严重危害人类健康的神经系统常见慢性疾病之一。癫痫发作影响了0.5%-1.5%的全球人口,给患者个人、家庭和社会带来了沉重负担,是神经科学研究的热点。有大约20-30%的癫痫患者经过规范使用一线抗癫痫药物治疗后不能有效控制发作而成为难治性癫痫。难治性癫痫是目前医学上急需解决的问题之一。难治的原因除了癫痫病因复杂,还与目前癫痫发作的发病机制仍不明确,不能根据发作机制中的关键环节开发新药物、寻求新的治疗途径有关。颞叶癫痫是难治性癫痫中最常见的综合征,一直以来都是临床癫痫治疗的难点。近几十年来,对颞叶癫痫发病机制的研究持续成为癫痫研究的热点。大量的研究表明：颞叶癫痫的解剖起源位于海马,其主要的病理基础是海马硬化,主要表现为神经元丢失和胶质细胞增生。目前,没有任何一种抗癫痫药物能够阻止癫痫敏感个体在受到颅内感染、脑外伤及热性惊厥等中枢神经系统损害后癫痫发作的发生和发展。最近的研究提示：癫痫发作,有可能由脑的免疫反应易化或触发。持续的炎症可能是慢性癫痫的一个基本机制。近年来,胶质细胞的免疫反应在癫痫发病机制中的作用成为研究的热点。胶质细胞广泛分布于中枢神经系统,主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞,具有支持、滋养神经元的作用,并在神经系统损伤时有分裂增殖与再生修复等作用。胶质细胞中的小胶质细胞和星形胶质细胞,与炎症诱发的免疫反应有关,负责对可能导致癫痫发作的脑损伤的监视。脂多糖(LPS),亦称内毒素,是革兰阴性菌细胞壁的主要成分之一。可被Toll样受体4识别并激活胶质细胞的固有免疫反应,是致炎剂中目前研究最透彻、最经典的,并且也是最常用的。一氧化氮(NO)在癫痫发生中的作用已得到广泛关注。NO是一种气体分子介质,由L-精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化生成,中枢神经系统中有3种NOS同工酶,即诱导型(iNOS)、神经元型(nNOS).内皮型(eNOS)。其中nNOS是脑组织中含量最多的NOS同工酶,其催化生成的NO以扩散方式直接作用于邻近细胞。研究证实海马CA区NO过度表达可致癫痫的反复发作,造成神经胶质细胞的增生和神经元的缺失。大量研究显示NO参与了癫痫发作的发生发展。细胞因子是一组多肽或蛋白,其经典功能是介导和调节免疫应答,刺激造血功能,参与组织修复等。近年的研究表明,神经胶质细胞具有细胞因子受体并能合成和分泌多种细胞因子。白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是两种重要的细胞因子,临床癫痫患者血清中二者含量升高,推测与癫痫发病有关。对大鼠癫痫模型的研究结果显示IL-1β和TNF-α在癫痫发作急慢性期的脑组织中均高表达,提示其可能参与了癫痫的形成过程。对星形胶质细胞培养给予LPS刺激可导致IL-1和TNFa的产生。然而激活TLR4对星形胶质细胞的作用尚未在体内证实。目前有研究证明在癫痫实验模型中固有免疫反应可降低癫痫发作的阈值,但目前尚无可以证实固有免疫反应可以单独在活体内导致癫痫发作的研究。本实验采用LPS海马内注射引发中枢神经系统的炎症反应,模拟中枢神经系统对损伤和感染的炎症反应,明确炎症是否可作为独立的致痫因子,单独在活体内导致急性及慢性癫痫发作,能否引起海马硬化的病理改变。并初步探讨其致痫机制：研究LPS海马内注射是否能导致大鼠海马神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达的改变,监测LPS体内激活TLR4对IL-1β和TNF-α表达的作用。本研究分三个部分：第一部分海马内注射脂多糖导致大鼠痫性发作及海马硬化目的研究海马内注射脂多糖是否可激活胶质细胞的免疫反应,引起大鼠急性痫性发作和慢性期自发性痫性发作,是否可导致海马硬化。方法1.36只成年雄性Wistar大鼠随机分为3组(每组12只),在大鼠CA3区应用立体定位仪分别注射1.5μl脂多糖(5ug/ul),生理盐水,海人酸(0.4ug/ul)。并分别于运动感觉皮层区及注射点对侧海马处置入电极,从给药开始连续记录大鼠脑电变化和监测大鼠苏醒后行为学变化2h。大鼠行为学改变采用Racine标准进行评分；2.于海马内注射后30d,各组大鼠用多聚甲醛心脏灌注后取脑,固定,石蜡包埋,将右侧海马区组织制成组织切片,行HE染色,显微镜下观察右侧海马CA1、CA2、CA3区和齿状回门区(dentate gyrus, DG)神经元的形态及其数目分布；3.于海马内注射后30d,将右侧海马区组织制成组织切片,通过应用免疫组化法检测大鼠右侧海马各分区及DG区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察星形胶质细胞的形态学表现,并行显微镜下GFAP阳性细胞计数；4.所有切片分析在同一强度,同一放大倍数下进行。每只大鼠随机取相同部位的6张切片,分别对海马各分区阳性细胞进行计数。采用SPSS17.0统计软件进行分析,所有数据以x±s表示。采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.海马内注射后NS组大鼠未见痫性发作。LPS组和KA组大鼠海马内注射后2h内出现不同程度的痫性发作,KA组发作等级高于LPS组。部分LPS和KA组大鼠在给药后3-4周仍可见癫痫发作。2.海马内注射后2h内NS组大鼠脑电图呈基本节律(基础脑电10-20Hz、35-60μV),LPS组或KA组脑电图可见异常放电(尖波或棘波6～50Hz,60～220μV)。3.海马内注射30d后取材行HE染色示：KA组和LPS组大鼠海马各区及齿状回(dentate gyrus, DG)均可见神经细胞排列松散、紊乱、形状模糊。两组各区细胞数明显少于NS组(P<0.05)。行GFAP染色示：NS组海马各区及DG区可见少量GFAP阳性细胞表达,KA组和LPS组GFAP阳性细胞数显著多于NS组(P<0.05),并可见胞体增生肥大、细胞树突变长增粗肥大畸形,细胞排布紊乱,广泛侵入神经元脱失的锥体细胞层,形成胶质瘢痕。4.海马内注射30d后KA组和LPS组大鼠海马均存在神经元缺失和胶质细胞增生,有不同程度的海马硬化表现。结论根据海马内注射后大鼠行为学和EEG的改变证实海马内注射LPS可致大鼠急性癫痫发作和慢性期自发发作,LPS可导致神经细胞缺失,并激活胶质细胞导致胶质瘢痕形成海马硬化。第二部分海马内注射LPS对大鼠海马神经型一氧化氮合酶表达的影响目的研究海马内注射LPS后的急性期大鼠海马神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达的变化,以探讨LPS的致痫机制。方法1.36只成年雄性Wistar大鼠随机分为3组(每组各12只),应用立体定位法在大鼠CA3区分别注射1.5μl脂多糖(5ug/ul),生理盐水,海人酸(0.4ug/ul)；2.于海马内注射后6h,将各组大鼠用多聚甲醛心脏灌注后取脑,固定,经石蜡包埋后,将右侧海马区组织制成组织切片,采用免疫组化法检测右侧海马CA1、CA2、CA3区和DG区nNOS的表达；3.所有切片分析在同一强度,同一放大倍数下进行。每只大鼠随机取相同部位的6张切片,分别对右侧海马各分区nNOS阳性细胞进行观察测定。结果1.nNOS表达阳性细胞胞浆及突起呈棕色或棕褐色着色。2.海马内注射6h后NS组大鼠海马各区神经元胞浆可见少量的nNOS表达,阳性物质颗粒呈棕黄色,颗粒稀疏。3.海马内注射6h后KA组大鼠海马区区神经元胞浆镜下见阳性物质染色深,颗粒粗。4.海马内注射6h后LPS组海马区神经元胞浆阳性物质染色介于KA组和NS组之间。结论LPS海马内注射可引起海马区nNOS表达的提高,导致神经元的损伤,推测其可能为LPS致痫的机制之一。第三部分LPS致痫大鼠海马细胞因子IL-1β、TNF-α水平变化目的研究LPS海马内注射对大鼠海马细胞因子IL-1β、TNF-α水平变化的影响。方法1.84只成年雄性Wistar大鼠随机分为2组,立体定位在大鼠CA3区分别注射1.5μl LPS (5ug/ul),生理盐水。2.给药后,分别于0.5h,2h,6h,12h,18h,24h,36h时间点将各组大鼠断头取脑,冰上快速分离海马,冰冷生理盐水冲洗后,放-80℃冰箱保存备用。3.标本加入5倍体积0.1M PBS(内含1μg/L蛋白酶抑制剂),冰浴中充分研磨,2500×g离心20min,取上清液检测。4.严格按照Elisa试剂盒说明书进行IL-1β和TNF-α浓度检测。5.统计学分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验。统计分析采用SPSS17.0统计软件进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.LPS组大鼠海马内注射后0.5h,2h,6h,12h,18h,24h,36h各时间点IL-1β和TNF-α浓度均高于生理盐水组(P<0.05)。2.LPS组大鼠海马内注射后IL-1β浓度逐渐升高,至18h浓度达到高峰,其后出现下降趋势。生理盐水对照组各时间段数值未见明显变化趋势,各组间差异无显著性(P>0.05)3.LPS组大鼠海马内注射后TNF-α浓度升高,至2h浓度达到高峰,其后出现下降趋势。生理盐水对照组18h时浓度较其它时间段高,但无显著性(P>0.05)。结论LPS大鼠海马内注射可激活固有免疫反应,导致海马内细胞因子IL-1β和TNF-α的浓度升高。IL-1β于注射后18h达到高峰,TNF-α于注射后2h达到高峰。