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水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的一种破坏性极大的细菌性病害,长期以来对水稻的产量造成巨大的损失。Xoo对宿主水稻的成功侵染不仅依赖各种致病因子的作用,还需要克服在侵染过程中遭遇的各种环境压力。研究Xoo的毒力因子和其克服环境压力的策略具有重要意义。氧在病原菌与宿主的互作中起重要的作用。研究表明,病原菌在侵染宿主的过程中会诱导宿主局部低氧环境的产生。Xoo侵染水稻的过程中会诱导维管束内低氧环境的产生,使Xoo遭遇低氧环境的胁迫。Xoo是一种好氧细菌,低氧环境不利于其生长繁殖;另一方面,低氧可作为一种信号被Xoo所感知进而调控自身相关基因的表达以适应低氧环境并启动侵染相关的机制。为研究Xoo在低氧胁迫下的应对策略,本课题以Xoo PXO99A为研究对象探索Xoo在低氧不利条件下的生长、代谢和致病因子的表达调控变化。首先我们对低氧和常氧两种条件下培养的PXO99A总蛋白进行提取和鉴定。对两种条件下的蛋白质进行比较分析发现在常氧和低氧条件下分别有187和140个蛋白质被特异检测到。通过WEGO(Web Gene Ontology Annotation Plot)对这些常氧和低氧条件下特异检测到的蛋白质进行GO(Gene Ontology)功能分类,可分别分为34和32类。GO富集(GO enrichment)分析发现常氧条件下被特异检测到的蛋白质主要富集在趋化性和细胞壁合成相关途径,而低氧条件下被特异检测到的蛋白质主要富集在芳香族氨基酸合成相关途径。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析显示常氧和低氧条件下被特异检测到的蛋白质分别参与到48和64条代谢途径中,其中分别有17和33条代谢途径是低氧和常氧条件下所特有的。低氧条件下所特有的代谢通路有糖酵解/糖异生、蛋白质运输、丙酸代谢和丁酸代谢等途径。跟据以上分析,我们选取了15个在低氧条件下被特异检测到的蛋白质研究Xoo在适应低氧条件下的毒力机制。选取的15个蛋白可分别参与到细菌粘附、芳香族氨基酸合成、糖酵解、丁酸或丙酸代谢相关途径中。通过同框缺失敲除对15个蛋白的编码基因进行敲除得到10个同框缺失突变体。以敏感水稻MH63为靶标对缺失突变体的致病力进行检测发现乙酰酯合成酶2催化亚基蛋白PXO02606功能缺失时导致致病力丧失,而葡糖激酶PXO00609和F5/8 type C结构域蛋白PXO01697功能缺失时导致致病力下降。进一步的实验发现,PXO02606的同框缺失突变体在贫瘠培养基XOM2中表现出生长缺陷,其致病力丧失是因为生长缺陷造成的。对PXO00609和PXO01697的功能进行初步探索发现,PXO00609的缺失导致胞外多糖(EPS)产量和运动能力相对野生型菌株明显减弱。以上结果表明,在低氧条件下Xoo通过PXO00609促进EPS的合成和细菌的扩散进而促进其感染。PXO01697由N端信号肽、F5/8 type C和AfuC(Alpha-L-fucosidase)保守结构域三部分组成。AfuC结构域属于岩藻糖苷酶超家族,与碳水化合物的代谢和运输相关。F5/8 type C可与脂质、多糖和蛋白质相互作用并参与到细胞的粘附中。粘附作用是病原菌侵染宿主的关键步骤,粘附因子可被宿主识别而引起宿主的初级免疫反应PTI(PAMP-triggered immunity)反应。利用农杆菌在烟草叶片上瞬时表达PXO01697发现其可以在引起非宿主植物烟草上引起PTI反应。因此,我们认为PXO01697通过F5/8 type C结构域特异性的识别并结合宿主细胞壁或细胞外基质的碳水化合物,并通过a-L-岩藻糖苷酶对其进行降解促进Xoo的感染。