研究背景与目的：高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的最主要致病因子,但研究已证实90%以上感染在无任何干预的情况下可自行抑制,仅5%～10%发展为持续感染,而仅持续感染与子宫颈癌的发生有关。因此,高危HPV是宫颈癌发生发展的必要因素而不是充分因素,也就是说宫颈癌的发生发展过程中除了HPV也有其他一些因素的参与,然而目前这方面的机制不是很清楚。只有了解其发生机制,才有利于制定治疗方案,阻断癌变的发展,从根本上抑制宫颈癌的发生。上皮间质化(EMT)和肿瘤干细胞学说是目前肿瘤发生发展机制中的主导学说。研究EMT的发生机制及其调节因素在肿瘤生长、逃逸、转移中的作用,以及如何阻断这一机制的发生,在肿瘤的诊断治疗中有重要意义,势必成为肿瘤研究的新热点。Weinberg等最近发现,发生EMT的乳腺癌细胞除获得抗凋亡能力外,还产生了部分干细胞的特性,如自我更新等。EMT不仅使癌细胞从原发肿瘤播散出去,也赋予了它们类似于干细胞的自我更新能力,为进一步研究肿瘤发生发展的机制提供新的思路。通过本研究我们想证实EMT对HPV感染宫颈上皮后恶性转化过程中产生干细胞特性的细胞,进一步明确宫颈癌的发病机制,完善和补充人们对宫颈癌发病机制的认识；为早期防治宫颈癌的新策略尊定实验和理论基础。材料方法1.筛选、鉴定TGF-β1和TWIST诱导的EMT改变的Ect, End和Siha细胞系Ect、 End、 Siha细胞通过TGF-β1诱导EMT改变。构建pcDNA4.0-TWIST载体,并筛选出稳定表达TWIST的End和Siha细胞。检测诱导EMT前后细胞EMT相关标志物的表达变化。2.研究EMT改变后宫颈上皮细胞具有干细胞特性分别在mRNA和蛋白水平上检测TGF-β1和TWIST诱导所引起的EMT改变前后的Ect、End和Siha细胞干细胞相关标志物的表达变化。3.宫颈癌干细胞的体外功能研究已经EMT诱导的宫颈干细胞通过细胞球形成实验、ck10ck13的免疫荧光检测实验来证实干细胞的自我更新能力、多项分化潜能。结果1.EMT转录因子TGF-β1和TWIST在HPV永生化的宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞中成功诱导出EMT改变。2. TGF-1和TWIST所发生的EMT改变在宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞中诱导出具有干细胞特性细胞。3.体外成功验证在宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞中EMT改变所诱导的干细胞特性具有自我更新能力、多项分化潜能。结论EMT发生的关键因子TGF-β1和TWIST在体外HPV永生化的宫颈上皮细胞及宫颈癌细胞中可以诱导出具有自我更新能力、多项分化潜能的干细胞特性的细胞,从而参与了宫颈癌的发生发展。背景：癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是由美国国立癌症研究所(NCI)及国立人类基因组研究所(NHGRI)於2006年启动的大型研究。此计划试图通过应用基因组分析技术,特别是采用大规模的基因组测序,将人类全部癌症(近期目标为50种包括亚型在内的肿瘤)的基因组变异图谱绘制出来,并进行系统分析,旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异,了解癌细胞发生、发展的机制,在此基础上取得新的诊断和治疗方法,最后可以勾画出整个新型“预防癌症的策略”。前期一些卵巢癌研究因为样本量太小,很少有化疗耐药相关报道基因的重叠。最近,TCGA研究网络获得了卵巢癌基因组改变的全面图谱并把数据向公众开放。TCGA数据库具有超大的样本量,全面的分子特征及临床预后信息。因此,在这项研究中,我们使用了TCGA大样本量卵巢癌患者数据来整合分析拷贝数变异和基因表达改变与浆液性卵巢癌化疗耐药的相关性。方法和结果：TCGA卵巢癌数据库的569个肿瘤样本的基因表达和拷贝数变异数据以用半监督聚类分析方法结合一种新的打分函数来分析。然后建一个基因调控网络进一步查明负责化疗耐药组和化疗敏感组之间的差异表达基因的拷贝数变异的基因。我们已经确定了在化疗耐药组中有460个基因的重大缺失或扩增。通过与基因表达数据整合分析,我们预测94个基因的拷贝数改变同时与基因表达相关。其中,13个重要的基因和六个关键信号通路在化疗反应中具有重要的意义。此外,13个潜在的血清标志物被认为可能预测浆液性卵巢癌的化疗耐药性。结论：在大量样本中所发现的基因特征更准确的预测浆液性卵巢癌的化疗反应。拷贝数变异和基因表达的整合分析有助于理解化疗耐药性的潜在机制。目的构建含肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)的重组腺相关病毒(rAAV-LIGHT),探讨(rAAV-LIGHT)对TC-1细胞株所建立的小鼠宫颈癌模型的抑瘤效应的可行性。方法用基因重组方法构建含LIGHT全长的重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP,磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞中,分别合成rAAV-LIGHT和rAAV-GFP.并用实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV-LIGHT对TC-1细胞的转染效率。体外用淋巴毒性试验来检测LIGHT的免疫效应。小鼠细胞系TC-1(转染过E6E7RAS)用于建立小鼠宫颈癌模型。成瘤第3天对空白对照组(5只小鼠),rAAV-GFP(5只小鼠),rAAV-LIGHT(5只小鼠)组分别进行肌肉注射。观察其生物特性及用实时定量PCR检测肿瘤微环境中LIGHT和其他细胞因子的表达情况。观察rAAV-LIGHT的抑瘤效应。通过流式细胞仪和肿瘤组织H&E染色、免疫组化检测小鼠淋巴细胞增值效应。结果成功构建并鉴定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP,滴度为2.5×1010v.g/ml,转染效率为60%。SPSS13.0分析结果显示rAAV-LIGHT组肿瘤大小明显小于对照组及rAAV-GFP组(P=0.0055,P=0.029P<0.05)。对照组及rAAV-GFP组比较无明显统计学意义(P=0.115P>0.05)。结论rAAV-LIGHT通过诱导细胞毒性细胞、增加炎症因子的分泌及刺激性细胞因子的表达来逆转肿瘤生长。