病理性血管重塑（vascular remodeling）是指血管壁结构对血流变化、机械负荷或者血管损伤所发生的失代偿性改变，进而可导致许多血管疾病的发生和发展，比如动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄以及血管旁路移植失败等。新生内膜形成是血管重塑的主要病理特征之一，病理学基础主要为局部炎性细胞的浸润和中膜平滑肌细胞的增殖和迁移。大量研究表明，炎症应答在引发和加剧血管重塑中起关键作用，表现为单核/巨噬细胞浸润以及炎性介质的释放，由此触发血管平滑肌细胞（vascular smoothmuscle cells, VSMCs）向内膜下迁移和增殖，最终导致管腔狭窄甚至闭塞。MicroRNAs（miRNAs）是体内存在的一类非编码小RNA，长度通常不超过22个核苷酸，主要通过抑制翻译或促进mRNA降解在转录后水平调控基因表达。研究证实，许多miRNAs都参与了血管重塑过程。MicroRNA-155（miR-155）是一个炎症相关miRNA，在巨噬细胞和动脉粥样硬化斑块中表达上调。miR-155通过靶向抑制巨噬细胞炎症应答来发挥促炎或抗炎的作用。近期研究表明，miR-155在动脉粥样硬化中同样具有抗斑块形成和促斑块形成的双重作用，但其在血管重塑及新生内膜形成中的作用还尚不清楚。通心络是一种中药复方提取物，由人参、赤芍、酸枣仁、檀香、降香、土鳖虫、蜈蚣、水蛭、蝉蜕、全蝎、乳香及冰片组成。该药已显示出多种血管保护样作用，包括降血脂、抗氧化、抗血栓形成、改善内皮细胞功能、促进血管新生以及抑制炎症反应等。抗炎是通心络发挥血管保护作用的主要机制之一，miRNA是否介导或参与通心络抑制血管炎症反应的过程目前还尚不清楚。因此，本研究利用小鼠颈动脉结扎模型诱导血管内膜增生，探讨通心络是否通过调控miR-155的表达而发挥抑制血管炎症及血管重塑的作用，旨在为阐明通心络的血管保护分子机制以及扩大临床应用范围提供实验依据。第一部分通心络抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生和血管炎症反应目的：观察通心络对颈动脉结扎诱导的内膜增生和局部炎症应答中的抑制作用。方法：1于左侧颈总动脉近分叉处结扎C57BL/6小鼠颈总动脉诱导内膜增生。2应用苏木精-伊红染色和Image-Pro Plus Analyzer version5.1软件观察和评价内膜增生的形态学改变。3qRT-PCR检测VEGF-α、FGF-b、TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。4应用mac-2和SMA免疫荧光双重染色观察巨噬细胞浸润和血管平滑肌细胞增殖。5免疫组化法观察TNF-α和IL-1β的表达量。结果：1通心络抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生形态学分析显示，颈动脉结扎7天后既有新生内膜形成，到结扎后14天内膜增生进一步加重，到结扎后21天，新生内膜大量增加至血管壁厚度的70%以上。与结扎组相比，通心络低剂量、中剂量和高剂量灌胃组（于术前3天开始，每天灌胃给药一次）结扎血管的内膜面积和I/M比值在3个时间点（7、14和21天）均显著减少。同时，通心络中剂量和高剂量灌胃组对内膜增生的抑制作用比通心络低剂量灌胃组更显著。以上结果说明，通心络呈剂量依赖性抑制颈动脉结扎诱导的新生内膜形成。2通心络抑制颈动脉结扎诱导的炎性因子的表达qRT-PCR结果显示，在颈动脉结扎后21天，结扎血管中的TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平均比对照组血管显著升高。尤其是TNF-α的mRNA水平达对照组的17倍。与结扎组相比，通心络中剂量灌胃组显著降低了PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平，但没有影响TGF-β的mRNA水平。这些结果说明，通心络对颈动脉结扎诱导的炎性因子的上调有显著的抑制作用。3通心络抑制颈动脉结扎诱导的巨噬细胞浸润和血管平滑肌细胞增殖，减少结扎血管中TNF-α和IL-1β的产生免疫荧光结果显示，在颈动脉结扎后21天的血管新生内膜中有大量巨噬细胞浸润，同时伴有血管平滑肌细胞的大量增殖。然而，在通心络中剂量灌胃组的结扎血管中，几乎观察不到巨噬细胞的浸润，中膜平滑肌细胞的增殖和迁移也不明显。免疫组化显示，与对照组相比，损伤21天后结扎血管的新生内膜中有大量TNF-α、IL-1β的产生，而通心络中剂量灌胃显著抑制了结扎血管中TNF-α和IL-1β的表达。4结扎后再给予通心络干预仍然可以显著抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生形态学结果显示，于颈动脉结扎后3天再给予通心络中剂量灌胃，与结扎组相比，在术后21天仍然抑制了血管内膜增生，但抑制作用与术前预干预组比较有所减弱。小结：通心络可以显著抑制小鼠颈动脉结扎诱导的内膜增生，其作用与减少巨噬细胞浸润从而减轻局部炎症反应有关。第二部分通心络通过下调miR-155的表达发挥抑制内膜增生的作用目的：观测miR-155是否参与颈动脉结扎诱导的新生内膜形成过程，以及通心络是否通过调节miR-155的表达来发挥抑制内膜增生和血管炎症反应的作用。方法：1对miR-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠行左侧颈总动脉结扎术。苏木精-伊红染色和Image-Pro Plus Analyzerversion5.1软件观察和评价内膜增生的形态学改变。2将腺病毒载体Ad-miR-155（空载体Ad-null作为对照）经尾静脉注射导入WT小鼠体内过表达miR-155。3qRT-PCR检测miR-155、TNF-α和IL-1β的表达水平。4mac-2免疫组化染色观察巨噬细胞浸润；免疫组化染色观察TNF-α的表达量。结果：1通心络抑制颈动脉结扎诱导的miR-155的表达与未结扎的对照组相比，miR-155在颈动脉结扎14天和21天后的小鼠血管中均显著上调，通心络中剂量灌胃在结扎后14天和21天均明显抑制了结扎血管中miR-155的表达。在颈动脉结扎7天后的结扎组和通心络中剂量灌胃组的血管中miR-155的表达没有明显变化。2miR-155缺失抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生，而miR-155过表达部分拮抗了通心络对内膜增生的抑制作用形态学分析显示，颈动脉结扎21天后，WT小鼠血管中有大量新生内膜形成，而miR-155-/-小鼠的结扎血管，无论是I/M比值还是内膜面积均显著低于WT小鼠，说明miR-155的缺失抑制了颈动脉结扎诱导的内膜增生。同时，在miR-155-/-小鼠给予通心络中剂量灌胃后，其结扎血管中的内膜增生进一步减少。给通心络中剂量灌胃的WT小鼠尾静脉注射Ad-miR-155（于术前1天开始注射，每隔7天注射一次，共注射3次），与Ad-null注射组比较，在结扎21天后的血管中miR-155上调3.5倍。在通心络中剂量灌胃的WT小鼠中，颈动脉结扎21天后，与Ad-null注射组相比，Ad-miR-155注射组的结扎血管中I/M比值和内膜面积均显著增加，说明miR-155过表达部分拮抗了通心络对内膜增生的抑制作用。3miR-155缺失抑制颈动脉结扎诱导的巨噬细胞浸润和炎性因子TNF-α和IL-1β的表达，而miR-155过表达部分拮抗了通心络对巨噬细胞浸润和TNF-α表达的抑制作用免疫组化结果显示，颈动脉结扎21天后，WT小鼠的结扎血管的新生内膜中有大量巨噬细胞浸润，而miR-155-/-小鼠的结扎血管中巨噬细胞显著减少。给予通心络中剂量灌胃的miR-155-/-小鼠的结扎血管中几乎观察不到浸润的巨噬细胞。同时，在通心络中剂量灌胃的WT小鼠中，与尾静脉注射Ad-null组相比，尾静脉注射Ad-miR-155组的结扎血管中浸润的巨噬细胞明显增多。qRT-PCR结果显示，在颈动脉结扎后21天，miR-155-/-小鼠结扎血管中TNF-α的mRNA水平减少到WT小鼠的11%。给予通心络中剂量灌胃的miR-155-/-小鼠的结扎血管中TNF-α的mRNA水平减少到给予通心络灌胃的WT小鼠的20%。此外，在通心络中剂量灌胃的WT小鼠中，与Ad-null注射组相比，Ad-miR-155注射组的结扎血管中TNF-α的mRNA水平升高了2.2倍。以上结果说明，miR-155介导了结扎血管中TNF-α的表达，而miR-155过表达拮抗了通心络对TNF-α表达的抑制作用。免疫组化显示，各组的TNF-α的表达水平与qRT-PCR结果一致。另外，与WT小鼠相比，miR-155-/-小鼠结扎血管中的IL-1β mRNA水平下降了50%，但给予通心络中剂量灌胃的miR-155-/-小鼠与给予通心络中剂量灌胃的WT小鼠组比较，IL-1β mRNA水平无明显变化，同时，在通心络中剂量灌胃的WT小鼠中，Ad-miR-155注射使miR-155过表达后并没影响结扎血管中IL-1β的mRNA水平。这些结果说明，通心络对IL-1β表达的抑制作用并不是通过调节miR-155的表达实现的。4在颈动脉结扎后期过表达miR-155仍可部分拮抗通心络对内膜增生的抑制作用在通心络中剂量灌胃的WT小鼠中，于颈动脉结扎术后第14天注射Ad-miR-155，与Ad-null注射组相比，Ad-miR-155注射组结扎血管的内膜增生加重，说明在血管重塑后期过表达miR-155仍可减弱通心络对内膜增生的抑制作用。小结：miR-155参与颈动脉结扎诱导的新生内膜的形成过程；通心络对颈动脉结扎诱导的内膜增生和血管炎症应答的抑制作用在一定程度上是通过抑制miR-155的表达实现的。第三部分通心络通过阻断miR-155与TNF-α之间的反馈环路抑制巨噬细胞炎症应答目的：揭示通心络调节miR-155表达以及抑制巨噬细胞炎症应答的分子机制。方法：1用不同因素处理原代培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）。2腺病毒感染实验用于在BMMs中过表达miR-155。3Westernblot检测p-Akt和Akt1的表达。4siRNA转染实验用于在BMMs中敲低Akt1。5qRT-PCR检测miR-155、TNF-α和IL-1β的表达水平。6ELISA检测BMMs培养基中TNF-α和IL-1β的含量。7伤口愈合实验。8细胞粘附实验。结果：1通心络通过阻断TNF-α和miR-155之间形成的正反馈环路而抑制巨噬细胞炎症应答qRT-PCR结果显示，与对照组相比，TNF-α刺激使miR-155的表达水平上升2.5倍，通心络预孵育以剂量依赖性的方式抑制TNF-α诱导的miR-155表达上调。另一方面，在对照组、IL-1β刺激组和通心络预孵育+IL-1β刺激组之间miR-155的表达水平无明显差异。这些结果说明，TNF-α可以促进BMMs中miR-155的表达，但IL-1β对miR-155的表达无影响。与Ad-null感染组相比，Ad-miR-155感染的BMMs中TNF-α的mRNA水平升高6倍。来源于miR-155-/-小鼠的BMMs中TNF-α的mRNA水平比WT组显著降低。与qRT-PCR结果相一致，ELISA检测结果显示，BMMs中过表达miR-155显著增加培养基中TNF-α的含量，而miR-155-/-小鼠的BMMs培养基中TNF-α含量比WT组明显下降。另一方面，miR-155过表达或敲除均未影响BMMs及其培养基中IL-1β的表达水平。以上结果显示，TNF-α和miR-155之间形成正反馈环路促进巨噬细胞的炎症应答。qRT-PCR和ELISA结果显示，与单纯过表达miR-155组比较，通心络预孵育减少了过表达miR-155诱导的TNF-α的表达上调，TNF-α的mRNA水平和培养基中的蛋白水平分别减少到过表达miR-155组的31%和78%。同时，miR-155-/-BMMs无论给予或不给予通心络预孵育，其TNF-α的表达均处于较低水平。这些结果表明，通心络可以阻断TNF-α和miR-155之间形成的正反馈环路，这可能是其抑制炎症应答发挥抗炎作用的机制之一。2通心络通过上调Akt1抑制巨噬细胞中miR-155的表达Western blot结果显示，BMMs被TNF-α刺激10、20和40分钟后p-Akt均轻微下调，通心络预孵育（2h）+TNF-α刺激组的p-Akt在三个时间点（10、20和40分钟）均显著上调。但是，通心络预孵育（2h）+TNF-α刺激组的总Akt1的蛋白水平在这三个时间点也显著上调。这些结果说明，通心络预孵育后p-Akt水平上升是由于上调了总的Akt1蛋白表达引起的。qRT-PCR结果显示，在BMMs中敲低Akt1后，通心络对TNF-α诱导的miR-155表达上调的抑制被消除，说明通心络抑制BMMs中miR-155的表达是通过上调Akt1实现的。3miR-155缺失抑制巨噬细胞的迁移，但不影响巨噬细胞的粘附伤口愈合实验结果显示，来源于miR-155-/-小鼠的BMMs在划痕后迁移的距离比WT小鼠的BMMs有所下降，说明miR-155缺失在一定程度上抑制了巨噬细胞的迁移。细胞粘附实验显示，与WT组相比，miR-155-/-BMMs与内皮细胞的粘附数量没有明显变化，说明miR-155缺失不影响巨噬细胞的粘附。小结：通心络通过阻断TNF-α和miR-155之间形成的正反馈环路而抑制巨噬细胞炎症应答；Akt1介导通心络对巨噬细胞中miR-155表达的抑制作用；miR-155缺失抑制巨噬细胞的迁移，但不影响巨噬细胞的粘附。结论：1通心络抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生。2通心络通过抑制炎性因子的表达和巨噬细胞的浸润而减轻血管炎症反应。3miR-155缺失抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生；通心络对内膜增生的抑制作用是通过抑制miR-155的表达实现的。4TNF-α和miR-155之间形成正反馈环路，通心络阻断TNF-α和miR-155之间的正反馈环路，从而抑制巨噬细胞炎症应答。5Akt1介导通心络对巨噬细胞miR-155表达的抑制。