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研究背景：
肿瘤坏死疗法(Tumor Necrosis Treatment,TNT)是伴随着单克隆抗体技术的发展而产生的一种新的肿瘤靶向治疗方法。肿瘤组织中存在自发坏死区域,TNT抗体可与坏死区域暴露的肿瘤细胞核抗原结合。TNT抗体具有广谱性和特异性,已有研究者证实TNT可以和包括小鼠在内的哺乳动物的肿瘤细胞核抗原结合。131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chimeric tumor necrosis therapymonoclonal antibody,131I-chTNT)是可应用于肿瘤坏死疗法的产品,能结合于哺乳动物的肿瘤变性坏死区内的细胞核抗原。但肿瘤组织的自发坏死有限,扩大肿瘤坏死区才能增加131I-chTNT结合的位点,增加肿瘤组织对131I-chTNT的摄取。影像引导经皮微波固化治疗技术(percutaneous microwave coagulationtherapy,PMCT)是20世纪90年代发展起来的一门新技术,局部高温可以使肿瘤组织凝固坏死,微波凝固治疗是诱导、增加肿瘤坏死区的有效方法。由此,我们设计了本实验,将微波凝固治疗和131I-chTNT治疗结合起来,先对肿瘤进行微波凝固治疗,产生坏死区域,然后注射131I-chTNT。研究微波凝固治疗序贯瘤内注射131I-chTNT后,药物在小鼠体内、瘤内分布的变化以及疗效的差异。同时,微波消融后形成的凝固坏死是否影响药物在肿瘤组织内的弥散和分布,药物注射的具体部位,即在消融范围中心注射(以下简称中心注射)还是消融范围的周边注射(以下简称偏心注射)效果更好,也是临床应用面临的现实问题,为此,我们也一并比较经中心注射和偏心注射后瘤内药物分布和疗效的差别,为临床应用提供参考。
第一章 微波消融对131I-chTNT在荷H22肝癌小鼠体内分布的影响及显像
目的：
研究微波治疗后肿瘤坏死区域的变化,微波消融对131I-chTNT在小鼠体内分布的影响及显像
方 法
1.建立小鼠H22肿痛模型。昆明小鼠70只,取处于对数生长期的H22肿瘤细胞,接种于5周龄的昆明小鼠的右侧背部皮下。两周左右,肿瘤最大直径达15mm时用于实验。
2.荷瘤小鼠的分组及处理。待肿瘤长至合适大小时,按照肿瘤大小均一性原则筛选51只荷瘤小鼠用于实验,按照完全随机原则分为3组:每组小鼠各17只,其中每组的12只用于测量组织器官的药物分布,剩余的每组5只用于131I核素扫描成像。A组,单药组,单纯瘤内注射131I-chTNT药物,18.5MBq/0.05ml:B组,微波消融序贯131I-chTNT中心注射治疗组(后文简称联合中心组),先给予微波凝固治疗,3天后在消融范围中心注射131I-chTNT,方法及剂量同A组；C组,微波消融序贯131I-chTNT偏心注射治疗组(后文简称联合偏心组),131I-chTNT注射3天前先给予微波消融,然后在肿瘤微波消融范围周边的肿瘤组织注射药物,方法及剂量同A组。
3.131I-chTNT在小鼠体内的分布情况。药物131I-chTNT注射1、3、5、7天后处死A、B、C组小鼠,每组每次各3只,收取感兴趣组织称重并用Y计数器测定放射性计数,计算每克组织的摄取百分比(％ID/g)。
4.实验小鼠的核素扫描成像:131I-chTNT注射后1、3、5、7天,A、B、C三组小鼠各取5只用于行131I核素扫描成像。观察成像情况并利用ROI(region ofinterest)技术测量和计算T/NT(tumor/normal tissues)比值。
5.统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件进行处理,定量资料数据用(x)±s表示,T/NT比值和采用重复测量的方差分析(Repeated Measure ANOVA),完全随机设计资料的数据采取单向方差分析(One-way ANOVO),方差齐时,多组间比较采用LSD法,方差不齐时,采用Welch校正方法,多组间比较用Dunnett法。P〈0.05为有统计学显著差异。
结果：
1.各组小鼠的组织分布:1、3、5、7后药物在各处理组正常组织的分布没有显著性差异,在肿瘤组织的分布,经过微波消融的B、C组显著高于单药组A,而中心注射组(B组)与偏心注射组(C组)没有显著性差异
2.实验动物的核素显像:各组注射药物1天后,肿痛区域明显有放射性浓聚,正常组织有少量分布,主要集中在肝、肾、肺等血流丰富器官。随着时间的延续,各组小鼠体内的正常组织放射性开始下降,但肿瘤的放射性持续存在,并一直维持在较高水平,第7天肿瘤仍有浓聚。
3.T/NT比值情况:各组肿瘤组织和非肿瘤组织的药物分布存在显著差异,经过微波消融组的B、C组的T/NT比值显著高于单药组A,而中心注射组(B组)与偏心注射组(C组)没有显著性差异。注药后开始,T/NT比值一直上升,在第5天达到高峰。
结论：
1.在注射131I-chTNT前先给予微波治疗,可增加药物在肿瘤组织的浓聚；
2.微波联合药物中心注射和偏心注射的分布未见明显差异。
第二章 微波消融序贯131I-chTNT对荷H22肝癌小鼠治疗作用的实验研究
目的：
研究药物瘤内注射后在瘤内的分布情况,探讨微波治疗序贯131I-chTNT瘤内注射治疗荷瘤小鼠的协同作用
方 法
1.建立小鼠H22肿瘤模型:昆明小鼠60只,建模方法同第一章。
2.荷瘤小鼠的分组及处理:待肿瘤长至合适大小时,根据大小均一性原则,筛选40只荷瘤小鼠用于实验,及按照完全随机原则分为5组:A组,单药组,10只小鼠,单纯瘤内注射131I-chTNT药物,18.5MBq/0.05ml；B组,微波联合药物中心注射治疗组,10只小鼠,药物注射前3天先给予微波凝固治疗,然后注射药物,方法及剂量同A组；C组,微波联合药物偏心注射治疗组10只小鼠,药物注射前3天先给予微波消融,然后在肿瘤微波消融范围以外的肿瘤组织注射药物；D组,单纯微波组,5只小鼠,只给予微波消融；E组,对照组,5只小鼠,瘤内注射0.05ml的生理盐水。
3.放射自显影及病理观察:A、B、C三组小鼠,每组5只,注射药物后5天分别处死各组小鼠。取小鼠的肿瘤组织和正常的肝脏及肾脏,常规制做病理切片,每个标本做两个连续切片,相邻切片分别行放射自显影和HE染色。观察HE染色和自显影的图片,比较不同组别之间肿瘤坏死区及正常组织区的放射性分布。
4.疗效观察:接种后每天观察小鼠的食欲、运动、毛色及精神变化。注射药物后用游标卡尺每3天测量一次肿瘤的最大直径(a)和最小直径(b),直至第28天。根据体积计算公式V=(a×b2)/2计算肿瘤体积,绘制小鼠肿瘤体积生长变化曲线。
5.统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件进行处理,定量资料数据用(x)±s表示,小鼠肿瘤的体积采用重复测量(Repeated Measure ANOVA)的方法,完全随机设计资料的数据采取单向方差分析(One-way ANOVO),方差齐时,多组间比较采用LSD法,方差不齐时,采用welch校正方法,多组间比较用Dunnett法,P〈0.05为有统计学显著差异。
结果：
1.瘤内分布情况:各组用药后3天肿瘤切片的放射自显影和HE染色提示:单药组肿瘤组织自发坏死少,药物在瘤内的分布也少,而微波联合组肿瘤组织坏死区域明显大于单药组,药物在瘤内的分布也多。药物在正常组织如肝脏和肾脏内未见分布。
2.药物的特异性结合的验证:对比放射自显影图片和HE染色图片,可以看到只有坏死区才和药物结合,非坏死区没有结合,正常的肝脏和肾脏也没有结合。
3.疗效的观察。不同处理小组小鼠的肿瘤生长情况不同。联合用药肿瘤生长显著减慢,体积显著小于对照组、单药组、单独微波组,P<0.05。
结论：
1.131I-chTNT能特异性结合于肿瘤坏死区域,在注射131I-chTNT前先给予微波凝固治疗,可增加131I-chTNT在肿瘤组织内的浓聚；
2.微波凝固治疗和瘤内注射131I-chTNT在疗效上两者之间具有协同效应；
3.微波联合药物中心注射和偏心注射的瘤内分布和疗效未见明显差异。
肿瘤坏死疗法(Tumor Necrosis Treatment,TNT)是伴随着单克隆抗体技术的发展而产生的一种新的肿瘤靶向治疗方法。肿瘤组织中存在自发坏死区域,TNT抗体可与坏死区域暴露的肿瘤细胞核抗原结合。TNT抗体具有广谱性和特异性,已有研究者证实TNT可以和包括小鼠在内的哺乳动物的肿瘤细胞核抗原结合。131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chimeric tumor necrosis therapymonoclonal antibody,131I-chTNT)是可应用于肿瘤坏死疗法的产品,能结合于哺乳动物的肿瘤变性坏死区内的细胞核抗原。但肿瘤组织的自发坏死有限,扩大肿瘤坏死区才能增加131I-chTNT结合的位点,增加肿瘤组织对131I-chTNT的摄取。影像引导经皮微波固化治疗技术(percutaneous microwave coagulationtherapy,PMCT)是20世纪90年代发展起来的一门新技术,局部高温可以使肿瘤组织凝固坏死,微波凝固治疗是诱导、增加肿瘤坏死区的有效方法。由此,我们设计了本实验,将微波凝固治疗和131I-chTNT治疗结合起来,先对肿瘤进行微波凝固治疗,产生坏死区域,然后注射131I-chTNT。研究微波凝固治疗序贯瘤内注射131I-chTNT后,药物在小鼠体内、瘤内分布的变化以及疗效的差异。同时,微波消融后形成的凝固坏死是否影响药物在肿瘤组织内的弥散和分布,药物注射的具体部位,即在消融范围中心注射(以下简称中心注射)还是消融范围的周边注射(以下简称偏心注射)效果更好,也是临床应用面临的现实问题,为此,我们也一并比较经中心注射和偏心注射后瘤内药物分布和疗效的差别,为临床应用提供参考。
第一章 微波消融对131I-chTNT在荷H22肝癌小鼠体内分布的影响及显像
目的：
研究微波治疗后肿瘤坏死区域的变化,微波消融对131I-chTNT在小鼠体内分布的影响及显像
方 法
1.建立小鼠H22肿痛模型。昆明小鼠70只,取处于对数生长期的H22肿瘤细胞,接种于5周龄的昆明小鼠的右侧背部皮下。两周左右,肿瘤最大直径达15mm时用于实验。
2.荷瘤小鼠的分组及处理。待肿瘤长至合适大小时,按照肿瘤大小均一性原则筛选51只荷瘤小鼠用于实验,按照完全随机原则分为3组:每组小鼠各17只,其中每组的12只用于测量组织器官的药物分布,剩余的每组5只用于131I核素扫描成像。A组,单药组,单纯瘤内注射131I-chTNT药物,18.5MBq/0.05ml:B组,微波消融序贯131I-chTNT中心注射治疗组(后文简称联合中心组),先给予微波凝固治疗,3天后在消融范围中心注射131I-chTNT,方法及剂量同A组；C组,微波消融序贯131I-chTNT偏心注射治疗组(后文简称联合偏心组),131I-chTNT注射3天前先给予微波消融,然后在肿瘤微波消融范围周边的肿瘤组织注射药物,方法及剂量同A组。
3.131I-chTNT在小鼠体内的分布情况。药物131I-chTNT注射1、3、5、7天后处死A、B、C组小鼠,每组每次各3只,收取感兴趣组织称重并用Y计数器测定放射性计数,计算每克组织的摄取百分比(％ID/g)。
4.实验小鼠的核素扫描成像:131I-chTNT注射后1、3、5、7天,A、B、C三组小鼠各取5只用于行131I核素扫描成像。观察成像情况并利用ROI(region ofinterest)技术测量和计算T/NT(tumor/normal tissues)比值。
5.统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件进行处理,定量资料数据用(x)±s表示,T/NT比值和采用重复测量的方差分析(Repeated Measure ANOVA),完全随机设计资料的数据采取单向方差分析(One-way ANOVO),方差齐时,多组间比较采用LSD法,方差不齐时,采用Welch校正方法,多组间比较用Dunnett法。P〈0.05为有统计学显著差异。
结果：
1.各组小鼠的组织分布:1、3、5、7后药物在各处理组正常组织的分布没有显著性差异,在肿瘤组织的分布,经过微波消融的B、C组显著高于单药组A,而中心注射组(B组)与偏心注射组(C组)没有显著性差异
2.实验动物的核素显像:各组注射药物1天后,肿痛区域明显有放射性浓聚,正常组织有少量分布,主要集中在肝、肾、肺等血流丰富器官。随着时间的延续,各组小鼠体内的正常组织放射性开始下降,但肿瘤的放射性持续存在,并一直维持在较高水平,第7天肿瘤仍有浓聚。
3.T/NT比值情况:各组肿瘤组织和非肿瘤组织的药物分布存在显著差异,经过微波消融组的B、C组的T/NT比值显著高于单药组A,而中心注射组(B组)与偏心注射组(C组)没有显著性差异。注药后开始,T/NT比值一直上升,在第5天达到高峰。
结论：
1.在注射131I-chTNT前先给予微波治疗,可增加药物在肿瘤组织的浓聚；
2.微波联合药物中心注射和偏心注射的分布未见明显差异。
第二章 微波消融序贯131I-chTNT对荷H22肝癌小鼠治疗作用的实验研究
目的：
研究药物瘤内注射后在瘤内的分布情况,探讨微波治疗序贯131I-chTNT瘤内注射治疗荷瘤小鼠的协同作用
方 法
1.建立小鼠H22肿瘤模型:昆明小鼠60只,建模方法同第一章。
2.荷瘤小鼠的分组及处理:待肿瘤长至合适大小时,根据大小均一性原则,筛选40只荷瘤小鼠用于实验,及按照完全随机原则分为5组:A组,单药组,10只小鼠,单纯瘤内注射131I-chTNT药物,18.5MBq/0.05ml；B组,微波联合药物中心注射治疗组,10只小鼠,药物注射前3天先给予微波凝固治疗,然后注射药物,方法及剂量同A组；C组,微波联合药物偏心注射治疗组10只小鼠,药物注射前3天先给予微波消融,然后在肿瘤微波消融范围以外的肿瘤组织注射药物；D组,单纯微波组,5只小鼠,只给予微波消融；E组,对照组,5只小鼠,瘤内注射0.05ml的生理盐水。
3.放射自显影及病理观察:A、B、C三组小鼠,每组5只,注射药物后5天分别处死各组小鼠。取小鼠的肿瘤组织和正常的肝脏及肾脏,常规制做病理切片,每个标本做两个连续切片,相邻切片分别行放射自显影和HE染色。观察HE染色和自显影的图片,比较不同组别之间肿瘤坏死区及正常组织区的放射性分布。
4.疗效观察:接种后每天观察小鼠的食欲、运动、毛色及精神变化。注射药物后用游标卡尺每3天测量一次肿瘤的最大直径(a)和最小直径(b),直至第28天。根据体积计算公式V=(a×b2)/2计算肿瘤体积,绘制小鼠肿瘤体积生长变化曲线。
5.统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件进行处理,定量资料数据用(x)±s表示,小鼠肿瘤的体积采用重复测量(Repeated Measure ANOVA)的方法,完全随机设计资料的数据采取单向方差分析(One-way ANOVO),方差齐时,多组间比较采用LSD法,方差不齐时,采用welch校正方法,多组间比较用Dunnett法,P〈0.05为有统计学显著差异。
结果：
1.瘤内分布情况:各组用药后3天肿瘤切片的放射自显影和HE染色提示:单药组肿瘤组织自发坏死少,药物在瘤内的分布也少,而微波联合组肿瘤组织坏死区域明显大于单药组,药物在瘤内的分布也多。药物在正常组织如肝脏和肾脏内未见分布。
2.药物的特异性结合的验证:对比放射自显影图片和HE染色图片,可以看到只有坏死区才和药物结合,非坏死区没有结合,正常的肝脏和肾脏也没有结合。
3.疗效的观察。不同处理小组小鼠的肿瘤生长情况不同。联合用药肿瘤生长显著减慢,体积显著小于对照组、单药组、单独微波组,P<0.05。
结论：
1.131I-chTNT能特异性结合于肿瘤坏死区域,在注射131I-chTNT前先给予微波凝固治疗,可增加131I-chTNT在肿瘤组织内的浓聚；
2.微波凝固治疗和瘤内注射131I-chTNT在疗效上两者之间具有协同效应；
3.微波联合药物中心注射和偏心注射的瘤内分布和疗效未见明显差异。