目的:根据RNA干扰(RNA interference，RNAi)设计原则，设计和构建适用于真核细胞表达的、与呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）感染人肺鳞状上皮细胞腺癌（SPC-A1）细胞相关的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）表达载体，将构建的重组质粒转染至SPC-A1细胞，通过体外抗病毒实验筛选有效的药物作用靶点，为找到潜在的抗RSV病毒感染的药物作用靶标奠定基础。 方法:通过mRNA差异显示法已经获得了与RSV感染SPC-A1细胞相关的52个表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST），从中选取与人类基因同源性较高的四个EST片断，NCBI登陆号分别为CB238799、CB238802、CB238810、CB238811，通过网上在线的siRNA设计软件，针对每个EST片断设计并化学合成两条编码小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的单链DNA，经退火形成双链后，将其克隆到经BglⅡ和HindⅢ 处理的线性pSUPER质粒载体上，获得四个重组RNAi 质粒shRNA8799/8802/8810/8811 。利用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒转染至SPC-A1细胞中，利用显微镜观察法、空斑实验、四甲基偶氮唑盐（MTT）等方法检测重组质粒对正常SPC-A1细胞的毒性和抑制RSV病毒感染的效果。 结果:① 经过酶切电泳及测序鉴定，已成功构建了四个重组质粒shRNA8799/8802/8810/8811。②MTT实验结果表明四个重组质粒无明显细胞毒性，转染后有三个重组质粒shRNA8802/8810/8811对RSV感染有明显抑制作用，而重组质粒shRNA8799仅能轻微提高RSV感染细胞的存活率。 结论:特异性靶向高表达EST序列的RNAi重组质粒能够在细胞培养中有效和特异地抑制RSV的感染，为今后抗病毒的研究提供了一种新的途径。