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研究目标:明确BRD4在人皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞中的表达及生物学功能,为SCC的分子靶向治疗提供有益的探索研究方法和内容:?CCK-8比色法、细胞集落试验(Clonogenicity assay)、Brd U酶联免疫吸附测定(ELISA)检测BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)处理不同时间后,对人皮肤SCC细胞存活及细胞增殖的影响;?TUNEL细胞核染色方法、Caspase-3/-9活性试剂盒、Annexin V-碘化丙啶(PI)流式细胞仪(FACS)法,及Western blotting方法检测BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)对人皮肤SCC细胞凋亡的作用;?碘化吡啶(PI)流式细胞仪法观察BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)处理后人皮肤SCC细胞周期的变化;?实时定量PCR(q RT-PCR)方法、Western blotting方法观察BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)处理后人皮肤SCC细胞多个促癌基因表达水平的变化;?在A431人皮肤SCC细胞中,运用sh RNA敲减BRD4,观察处理后癌细胞存活和增殖的变化;?在A431人皮肤SCC细胞中,运用CRISPR/Cas9方法敲除BRD4,观察处理后癌细胞存活和增殖的变化;?在A431人皮肤SCC细胞中,通过转染方法外源性过表达BRD4,,观察处理后癌细胞存活和增殖的变化;?建立SCID鼠荷A431瘤模型,观察敲除BRD4对A431细胞在体生长的影响。研究结果:?BRD4在人皮肤SCC细胞中呈现高表达。?BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)显著抑制人皮肤SCC细胞(包括A431细胞株和原代癌细胞)的存活和增殖。BRD4抑制剂对正常人皮肤细胞(角质细胞和成纤维细胞)无显著毒性作用。?BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)诱导人皮肤SCC细胞凋亡,并导致人皮肤SCC细胞周期阻滞。?在人皮肤SCC细胞中,添加BRD4抑制剂(JQ1和CPI203)诱导多个促癌基因(Cyclin D1,Myc和Bcl-2)的表达下调。?在A431人皮肤SCC细胞中,sh RNA敲减BRD4会抑制癌细胞存活和增殖。?在A431人皮肤SCC细胞中,CRISPR/Cas9方法敲除BRD4后,癌细胞存活和增殖水平下降。?在A431人皮肤SCC细胞中,外源性过表达BRD4促进癌细胞的存活和增殖。?CRISPR/Cas9敲除BRD4抑制A431人皮肤SCC细胞的在体生长。研究结论:BRD4在人皮肤SCC细胞中呈高表达,并参与癌细胞存活和增殖。