【摘 要】
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肌抑素(Myostatin,MSTN)又称为生长分化因子-8(GDF-8)，是转化生长因子-β超家族(TGF-β)成员之一。它是一个重要的肌细胞生长调控因子，主要功能是负向调控肌细胞的生长发育。本
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肌抑素(Myostatin,MSTN)又称为生长分化因子-8(GDF-8)，是转化生长因子-β超家族(TGF-β)成员之一。它是一个重要的肌细胞生长调控因子，主要功能是负向调控肌细胞的生长发育。本研究以南海黄鸡为研究对象，从鸡胚中抽取到鸡的总RNA，然后采用RT-PCR技术扩增了鸡MSTN基因片段，将其克隆到PMD18-T-Simple载体上，并进行了序列测定和分析；还构建了MSTN基因原核表达载体，进行了蛋白质诱导表达，并对表达产物进行了纯化。主要研究方法和结果如下：
1．MSTN基因的RT-PCR扩增参考GenBank中鸡MSTN基因序列，用Primer Premier5.0软件设计一对带有特定酶切位点的引物。从鸡胚中抽取鸡的总RNA，用RT-PCR方法进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，在预期的地方出现条带，大小约1053bp。
2．MSTN基因的克隆以及序列分析将目的片段连接到PMD18-T-Simple载体上构建重组质粒，并命名为PMD18-MSTN。制备感受态细胞DH5a，将重组质粒PMD18-MSTN转化感受态细胞，把菌液送公司进行序列测定。结果显示，克隆的目的片段由1053个核苷酸组成，与预期结果一致，经与GenBank中注册号为AF019621的序列相比较，核苷酸的同源性为99.6％，其相应氨基酸的同源性为99.4％。
3．MSTN基因的原核表达质粒的构建用一对内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ对重组质粒PMD18-MSTN进行双酶切得到目的片段MSTN，用同一对内切酶对质粒PET-32a进行双酶切得到载体，利用T4DNA连接酶将载体和目的片段进行连接，构建重组质粒，命名为PET-32a-MSTN。将重组质粒PET-32a-MSTN转化大肠杆菌BL21受体菌。将菌液进行PCR鉴定，挑选阳性菌落。从阳性菌中抽取质粒，进行PCR鉴定。结果显示，菌液PCR和质粒PCR都能扩增出一条1053bp的条带。
4．MSTN基因的蛋白质表达将阳性转化菌BL21置37℃摇床振荡培养2.5～3小时，使OD600值在0.5～0.6之间时，按0.5mmol/l的终浓度加IPTG进行诱导表达4h后，取样进行SDS-PAGE检测。结果显示，表达产物MSTN融合蛋白的分子量大约为60KD，与预期结果一致。
5．MSTN蛋白的Westen-blot检测用兔抗-MSTN高免血清(一抗)和羊抗兔IgG(二抗)对表达蛋白进行Western-blot检测，参照汪家政等人的方法。结果表明在60KD左右的位置出现一条特异性蛋白带，与预期结果一致，说明所表达的MSTN蛋白能与特异性抗体反应，具有很好的免疫原性。
6．MSTN蛋白纯化参照TALON Single Step columns试剂盒操作说明书纯化目的蛋白，纯化产物取样进行SDSPAGE检测。结果表明，MSTN蛋白经过纯化后能达到比较高的纯度，用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，结果显示MSTN蛋白的纯度能到90％。
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