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研究背景:肝癌在我国属于高发性肿瘤,一般男性多于女性,发病率约为28.7/10万,发病人数约占全球的半数以上,确诊时大部分患者已经为中晚期。根据我国卫生部公布的全国居民死亡原因调查结果显示,肝癌的死亡率位居恶性肿瘤的第二位,并且已位居我国肿瘤发病率第四。目前针对肝癌治疗的手段主要采取外科切除病灶和化疗两种手段,复发率很高,靶向药索拉菲尼也只能延长患者寿命,并不能完全治愈肝癌。因为早期肝癌的治愈率非常高,五年的生存率接近80%。因此肝癌的早期诊断在肝癌的治疗中就显得尤为重要。另外,抗体靶向治疗药物的开发,也给肝癌患者带来了福音,抗体治疗法具有特异性好和毒副作用小等特点,部分抗体靶向药物已经完成了临床前的试验。研究目的:本实验室通过分子克隆技术,克隆和表达重组GPC3N-端结构域(GPC3-ND);将表达纯化得到的重组GPC3-ND蛋白作为抗原免疫新西兰雄兔制备抗GPC3N-端结构域的多克隆抗体,并检测多克隆抗体和GPC3蛋白的结合;利用抗GPC3N-端结构域多抗去检测人原发性肝癌的组织切片上GPC3蛋白的表达;以本实验室构建好的全人源噬菌体抗体库为基础,初步筛选出与GPC3N-端结构域特异性结合的单链抗体序列。研究方法:利用PCR的技术方法克隆GPC3N-端结构域的基因,将pET-30a(+)作为表达载体,转化入大肠杆菌Rosetta表达菌株中诱导表达,超声破碎后经过Ni-NTA柱纯化,最终得到了纯度较高的的重组GPC3-ND蛋白。之后,将获得的重组GPC3-ND蛋白分多次免疫新西兰雄兔制备抗GPC3 N-端结构域的多克隆抗体;利用ELISA、Western blotting和免疫荧光技术检测抗GPC3N-端结构域多抗和重组GPC3N-端结构域蛋白的结合、和原发性肝癌细胞表面GPC3的结合。利用抗GPC3N端蛋白的多抗检测人的原发性肝癌组织的GPC3的表达,为廉价的GPC3高表达的原发性肝癌诊断试剂盒打下基础。将重组GPC3-ND与Ni-NTA珠子混合,使其相互结合,之后加入全人源噬菌体抗体库,经过多轮的洗涤,筛选和扩增,得到富集度高的结合GPC3N-端结构域蛋白的噬菌体。然后将第3轮筛选后富集度达到146倍的单克隆噬菌体进行测序,得到能够通读的且重链和轻链结构完整的单链抗体序列。研究结果:通过删去GPC3N-端结构域蛋白基因的第26-31位6个脯氨酸之后,在大肠杆菌Rosetta菌株中实现了重组GPC3-ND蛋白的表达,并通过镍柱纯化得到较高纯度的重组GPC3N-端结构域蛋白。利用得到的蛋白免疫新西兰雄兔得到具有能与重组GPC3-ND蛋白特异性结合的抗GPC3的抗体。经过Westernblotting和免疫荧光技术检测发现此多抗可以特异性地与GPC3阳性的原发性肝癌细胞HepG2和Huh7结合,而不与正常肝细胞L02结合。用该抗GPC3抗体去检测原发性肝癌病人组织,IHC结果显示阳性,而乳腺癌病人组织IHC组织结果显示阴性。经过噬菌体抗体库三轮筛选后,测序,共获得了 1株轻链和重链结构完整并可在TG1中通读的(具有琥珀密码子突变)的噬菌体抗体,完成了初步筛选。结论:成功优化了 GPC3N-端结构域蛋白的表达并纯化;成功制备了具有GPC3特异性结合能力的多抗,并利用多抗对病人的原发性肝癌组织的GPC3表达情况进行检测;完成了 GPC3N-端结构域蛋白的单链抗体的初步筛选。