异腈是一类同时具有亲核和亲电性质的特殊化学基团,含有异腈基团的天然产物一般都具有生物活性。从第一例异腈天然产物被发现到2016年的70年间,总共只有约200个异腈天然产物被分离鉴定,而其中双异腈化合物的数量更是非常少。经不完全统计,到2020年2月为止只有不超过10个双异腈天然产物的母核被报道。由于这些化合物具有如抑菌、金属螯合、抗疟和细胞毒性等生物活性,对它们的生物合成及作用机制进行研究在理解微生物的行为、微生物与环境互作和药物设计等方面是具有积极的意义的。课题组前期从硫藤黄链霉菌中成功克隆到一个双异腈天然产物SF2768的生物合成基因簇,通过分子生物学和天然产物结构鉴定等手段推测了其生物合成途径,同时证明了SF2768能特异性结合铜离子并以复合物的形式进入细胞。本文基于前期工作,对SF2768生物合成途径中的酶进行了系统的研究。通过体外重建生物合成途径,我们成功地利用四个生物合成酶Sfa B,Sfa C,Sfa D和Sfa E在体外合成了具有异戊酰基侧链的SF2768类似物,确定了SF2768骨架的合成机制;同时通过化学衍生化捕获了反应途径中的醛中间体,确认了所推测的合成途径的正确性。在此过程中,腺苷化酶Sfa B被发现具有一定的底物宽泛性,能识别多种小分子羧酸;随后我们通过化学显色法确定了所测试的75种小分子羧酸中Sfa B能够有效识别其中的23种并最终在体外合成了30种SF2768非天然类似物用于活性测定。此外本研究对SF2768合成途径下游的异腈水合酶Sfa F开展了研究,结果发现该酶能够顺序催化SF2768及其类似物的两个异腈基团水合,最终的产物失去了结合铜离子的能力。根据推测Sfa F可能具有两个功能:第一发挥自抗性功能,水合胞内积累的产物,防止胞内铜代谢紊乱;第二水合环境中其他微生物产生的异腈天然产物,起到化学防御的功能。异腈水合酶的同源蛋白在微生物中广泛存在,但相关研究却非常少,本研究第一次证明了异腈水合酶的生理功能,可以促进其他微生物中同源水合酶的研究。最后本研究对SF2768的抑菌机理进行了探究。通过包括胞内铜离子含量的测定、胞内ATP含量的测定、活性氧积累的检测以及SF2768类似物的活性测定等一系列实验结果,我们发现枯草芽胞杆菌与SF2768孵育后胞内铜离子减少,ATP的合成降低同时活性氧大幅积累,并进而提出SF2768结合了呼吸链上细胞色素c氧化酶的铜离子后产生了大量活性氧从而抑制了枯草芽胞杆菌的生长的假说。由此本研究提出了双异腈天然产物SF2768不仅可以为链霉菌从环境中获取铜离子,还能够对其他微生物产生氧化压力的模型,为理解异腈天然产物的功能带来了新的理解和认识。此外本研究还通过体外实验证明了SF2768及其双异腈类似物是有效的酪氨酸酶抑制剂,进一步确定了SF2768是一个铜离子依赖的酶的抑制剂,支持了本研究所提出的假设。课题组前期的实验证实SF2768是一个铜载体,本文除了对SF2768的合成与降解作出进一步研究外,还证实该化合物可以通过掠夺铜离子来抑制其他微生物的生长,是一个多功能的小分子。通过一系列研究本文提供了一个微生物利用特殊化学官能团实现对过渡金属的控制的案例,使我们对微生物-天然产物-过渡金属间的关系有了新的认识。