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目的：关于体外培养、鉴定间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)以及诱导MSCs定向分化为软骨细胞,目前尚缺乏相对完整和规范的实验方法。本课题拟通过对MSCs的体外培养、扩增,研究MSCs一般形态结构；通过流式细胞术、免疫荧光法结合MSCs分化功能法共同鉴定MSCs;胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导MSCs定向分化为软骨细胞,将不同时间段内单独使用和联合使用两种诱导因子对所诱导出的细胞Ⅱ型胶原表达量的影响相比较；通过光镜和电镜研究诱导前后MSCs细微、超微结构形态学改变,同时检测TGF-β1和IGF-1对MSCs增殖能力的影响,为进一步开发MSCs作为组织工程气管软骨种子细胞和体外构建组织工程气管软骨提供实验基础和技术可行性。方法：1MSCs获取、培养、纯化与鉴定1.1MSCs获取、培养及纯化：①颈椎脱臼处死大鼠,无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,取骨髓；②通过换液及传代去除杂质细胞。光镜观察细胞形态。1.2MSCs的鉴定：①形态学鉴定免疫荧光法；②表型鉴定流式细胞术；③功能鉴定诱导MSCs定向分化为软骨细胞。1.3MTT法检测采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测TGF-β1、 IGF-1及TGF-β1+IGF-1对MSCs增殖能力的影响。1.4扫描电镜观察MSCs诱导前形态。1.5透射电镜观察MSCs诱导前形态。2诱导MSCs定向分化为软骨细胞。2.1体外诱导及分组根据诱导分化因子使用方法,实验分四组：A组：50ng/ml IGF-1和10ng/ml TGF-β1。B组：10ng/ml TGF-β1。C组：50ng/ml IGF-1。对照组：单独使用DMEM高糖培养基,不加诱导分化因子。A、B、C组在DMEM高糖培养基里加入维生素C50μg/ml、胰岛素6.25μg/ml、地塞米松51.6ng/ml作为基础诱导分化液。取第四代MSCs按1×105/ml接种于六孔板,内置盖玻片行细胞爬片。光镜观察MSCs诱导后形态学改变。2.2扫描电镜观察MSCs诱导后形态学变化。2.3透射电镜观察MSCs诱导后形态学变化。2.4MSCs诱导分化软骨细胞后鉴定：①Ⅱ型胶原免疫荧光染色②RT-PCR检测③Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,多种方法共同鉴定MSCs诱导出的软骨细胞。结果：1光镜观察原代培养24h后首次换液,去除未贴壁细胞,大部分细胞呈梭型、三角形,小部分呈圆形。3代后细胞纯化,MSCs形态均一,杂质细胞极少见。诱导7d后MSCs形态开始发生改变,逐渐转变成三角形、星形、多边形,21d后绝大多数MSCs呈三角形、星形、多边形细胞形态,可见多个突起。2MSCs鉴定①流式细胞术检测显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90、 CD29,而极少表达CD34、CD45。②MSCs免疫荧光显示MSCs表达CD90、CD29阳性率在99%以上,而不表达CD34、CD45。3MTT法检测A组、B组和C组增殖活性高于对照组(P<0.05)。TGF-β1、IGF-1可增强MSCs增殖活性。4扫描电镜观察MSCs呈长梭形,扁平伸展状,可见突起。诱导两周MSCs体积增大,呈多边形、三角形、星形,可见多个突起。5透射电镜观察MSCs诱导前透射电镜见一个细胞核,可见一个核仁。胞浆见线粒体。细胞诱导7d后细胞核增大,核仁增多。诱导14d见线粒体、粗面内质网和空泡较7d时增加,可见较多的微绒毛和脂滴。诱导21d空泡和脂滴增加,可见数个髓鞘样小体。6MSCs诱导出软骨细胞后鉴定：6.1Ⅱ型胶原免疫荧光染色诱导21d后,A组、B组免疫荧光显示胞浆呈棕红色,高度表达Ⅱ型胶原,而C组和对照组结果呈阴性。6.2RT-PCR检测Ⅱ型胶原表达RT-PCR结果显示A组和B组电泳中可见Ⅱ型胶原扩增条带,呈阳性,C组和对照组呈阴性。6.3Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色A组和B组Ⅱ型胶原染色呈阳性,胞浆呈棕黄色。而C组和对照组结果呈阴性。以JEDR8010D形态图像分析软件VESION1.0扫描,结果显示A组Ⅱ型胶原表达量比B组显著提高(P<0.01),且随着时间的延长,表达量逐渐增加。结论：本实验采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养MSCs,培养出大量高度纯化的MSCs,可满足MSCs作为种子细胞构建组织工程气管软骨需求,全骨髓培养+贴壁纯化法是值得推荐的MSCs培养方法。流式细胞术、免疫荧光法结合MSCs分化功能法是目前MSCs较为理想的鉴定方法。TGF-β1与IGF-1对MSCs均有促增殖作用,MSCs诱导分化为软骨细胞时细微和超微结构改变提示细胞分化、代谢功能旺盛。联合使用TGF-β1、 IGF-1诱导MSCs在体外定向分化为软骨细胞,TGF-β1和IGF-1协同刺激MSCs分化为软骨细胞,可获得了较佳的诱导效应,从而构建出目前较为完整的、规范的体外培养MSCs、诱导MSCs定向分化为软骨细胞的模型,为进一步应用组织工程技术修复气管软骨缺损提供了实验基础与技术可行性。