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背景:胰腺癌(pancreatic adenocarcinomas)具有临床症状隐匿、易转移和侵袭性强等特点,晚期治疗缺乏有效的手段,致死率高,5年生存率仅为8%。吉西他滨(Gemcitabine,Gem)是胰腺癌治疗的一线化疗药物,它虽然在一定程度上可以改善患者的生存质量,但仍存在单药化疗有效率低于15%等问题。因此,为进一步改善吉西他滨对胰腺癌的治疗效果,迫切需要研究新的治疗策略。近年来,髓细胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)的过度表达已在胰腺癌等多种肿瘤中被证实,更与恶性肿瘤的发生发展密切相关。降低Mcl-1表达水平不仅可以直接促进肿瘤细胞发生凋亡,还可以显著提高肿瘤细胞的化疗敏感性。因此,靶向干预Mcl-1可以大大提高患者的术后生存率。相对于现有Mcl-1的小分子抑制剂药物,小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)技术因其特异性高和副作用小等特点在基因沉默和药物开发中被广泛关注。然而,si RNA存在透膜能力弱和易降解等缺点。因此,有必要找到一种可靠的载体,用于将si RNA有效地递送至细胞内部,发挥基因沉默作用。目前,已经开发出各种类型的si RNA递送系统,主要分为两类:病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体具有较高的转染效率,但是其存在特异性差、封装能力有限以及生物安全性等问题,限制了其在临床上的应用。而非病毒载体因其具有负载量大、可修饰性强、细胞毒性低和便于保存等优势成为了一种新兴的载体。其中,阳离子脂质体由于其制备简单、可重复转染和易降解等特点而被认为具有潜在的临床应用前景。1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)是最广泛使用的阳离子脂质体,它的价格相对便宜,并且在体外和体内应用中都具有良好的效果。目的:本研究中,我们利用DOTAP、胆固醇和鱼精蛋白构建了一种基于阳离子脂质体的基因递送系统(LPs)。DOTAP可通过带正电荷的阳离子头部与带负电荷的si RNA相互结合,将si RNA包封于脂质双分子层中,保护si RNA免受核酸酶降解并促使其顺利释放到细胞质中。胆固醇作为常见的辅助脂类,能够起到稳定脂质双分子层,降低阳离子脂质体毒性的作用。鱼精蛋白可以通过静电相互作用与si RNA结合,本身即可作为一种载体,通过与脂质基因载体配合使用,能够增强脂质基因载体的转染效率。另外,该递送载体还可以同时包载化疗药物。因此,我们利用合成的纳米载体共同递送Gem和Mcl-1 si RNA,形成LP-Gem-si Mcl-1,通过一系列体外和体内实验评价靶向Mcl-1干预对胰腺癌的作用以及Gem和Mcl-1 si RNA的协同抗肿瘤效应。方法:(1)我们利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和免疫印迹(western blot)技术确定了Mcl-1在胰腺癌中的表达情况,并检测了下调Mcl-1表达对Gem化疗敏感性的影响。(2)利用DOTAP、胆固醇和鱼精蛋白制备成纳米载体,包载Gem和Mcl-1si RNA,并对其表征进行检测。通过动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)及透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)检测所制备的纳米载体的粒径和电位大小,并观察纳米颗粒的形貌特征;利用超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)和琼脂糖凝胶电泳分别检测了Gem的包载率以及纳米载体对si RNA的吸附能力;共聚焦显微镜和流式细胞仪分析LPs的细胞内摄取以及亚细胞定位;免疫印迹和实时荧光定量PCR检测si RNA对细胞内Mcl-1的干扰效率。(3)在体外实验中,我们通过细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)和流式细胞术分别测定LP-Gem-si Mcl-1对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。(4)在体内实验中,通过建立小鼠的胰腺癌皮下移植瘤模型,绘制肿瘤生长曲线和组织学实验检测LP-Gem-si Mcl-1的体内抗肿瘤效果,并通过主要脏器的组织病理学分析以及血液生化指标的检测对所构建的纳米载体进行生物安全性评价。结果:(1)我们发现相对于正常组织和细胞,Mcl-1在胰腺癌中是过度表达的,与现有文献报道结果一致。通过瞬时转染si RNA下调Mcl-1的表达后,能够有效抑制胰腺癌细胞PANC-1和Bx PC-3的增殖,并且与Gem联合使用时,增强了Gem对胰腺癌细胞的杀伤效果。(2)纳米粒子的形态学表征:观察到制备的纳米粒子的粒径150-200nm左右,球形且呈单层分散状态;UPLC测得Gem的包载率约为19.3%;琼脂糖凝胶实验证实LPs具有较好的核酸吸附能力;共聚焦显微镜和流式细胞仪检测发现,LPs所包载的Gem和si RNA可以高效地被胰腺癌细胞摄取,并且定位在溶酶体中;进一步测得LP-si Mcl-1(LPs包载Mcl-1 si RNA)能够有效地抑制细胞内Mcl-1的表达。(3)体外实验中证实,与其他处理组相比,LP-Gem-si Mcl-1可以有效地抑制胰腺癌细胞增殖,并促进其凋亡的发生,效果明显高于LP-Gem(LPs包载Gem)和LP-si Mcl-1的单载组。(4)体内实验中,观察到LPs所载运的药物可以被动靶向于肿瘤部位,提高肿瘤部位的药物浓度。LP-Gem-si Mcl-1对肿瘤生长的抑制作用显著高于其他处理组,细胞增殖标志物Ki-67的表达也明显受到了抑制,证实了Gem和Mcl-1si RNA的协同抗肿瘤效应,并且LPs纳米材料无明显毒副作用。结论:综上所述,我们利用基于阳离子脂质体的药物和基因共递送系统成功地将Gem和Mcl-1 si RNA共同递送到胰腺癌细胞中,并证实了降低Mcl-1表达可以增强Gem对胰腺癌细胞的杀伤效果,二者具有协同抗肿瘤的作用。通过该研究,我们明确了靶向Mcl-1干预在胰腺癌治疗中的潜在价值,并利用阳离子脂质体递送系统验证了si RNA和化学治疗药物联合治疗胰腺癌的可行性,为胰腺癌的治疗新策略提供了理论依据和实验室基础。