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狂犬病毒（Rabies virus）是一种单股负链RNA病毒,基因组全长约12 kb,编码5个结构蛋白,包括糖蛋白（G）、核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）以及转录酶大蛋白（L）。狂犬病发病后死亡率几乎为100%,这是由于目前只能通过疫苗或免疫球蛋白进行紧急预防或阻断,而没有有效的药物对发病病人进行治疗。药物的市场空白让狂犬病成为一种使人闻风丧胆的急性病毒性传染病,这也使得针对狂犬病的药物研发变得十分必要且迫切。大蛋白（L）作为一种RNA聚合酶,在病毒的复制过程中起到非常重要的作用。它参与病毒RNA的转录以及病毒蛋白的表达,是狂犬病的潜在治疗靶标。病毒感染晚期诱导产生强烈的免疫应答是狂犬病致死的关键因素,尤其是趋化因子CCL5的过度累计反而加重患者病情。因此,CCL5可能成为一种有效的狂犬病治疗靶标。基于此,针对大蛋白和趋化因子CCL5筛选抗狂犬活性的双靶向核酸适配体有着巨大的潜在应用价值。本课题主要的研究内容和结果如下:第一部分:趋化因子CCL5蛋白特异性核酸适配体的筛选及鉴定。利用本实验室前期制备带有His标签的重组CCL5蛋白,与Ni-NTA亲和层析柱相结合,通过SELEX技术进行核酸适配体筛选。为保证筛选结果更加高效、可靠,我们首先采取负向筛选的策略,先将公司合成的随机DNA文库与Ni-NTA亲和层析柱结合,去除能与Ni-NTA亲和层析柱非特异性结合的核酸片段,再将该文库加入重组蛋白与亲和层析柱结合物中进行筛选,筛选共经历十轮。将最终得到的核酸适配体进行高通量测序。依据测序结果中适配体片段出现频次和ELONA结果,最终我们得到了一条具有高特异性和高亲和力的CCL5蛋白核酸适配体。第二部分:脑靶向制剂RVG29-9R短肽的制备及活性测定。构建p GEX-4T-1-RVG29-9R-His重组蛋白表达载体,转化入Rosetta菌种,在0.1 m M IPTG,30℃,200 rpm条件下诱导9 h。超声破碎后分离细胞上清与沉淀,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,可见目的蛋白在上清中有大量的可溶性表达。利用GST亲和层析柱纯化该重组蛋白并且通过凝血酶切割GST标签,凝胶阻滞及细胞ELISA实验分别证明其具有与核酸及神经细胞特异性结合的能力。第三部分:双特异性核酸适配体的组装及活性验证。在前期完成筛选和验证的CCL5蛋白核酸适配体和RABV-L蛋白核酸适配体3’端分别加入一段互补的linker序列,并依靠该序列完成双特异性适配体的组装。分别测定带有linker序列的L蛋白适配体对接毒细胞培养物中病毒增殖和病毒蛋白表达以及带有linker序列的CCL5蛋白适配体对细胞趋化活性的抑制情况。结果证明带有linker序列的L蛋白及CCL5蛋白适配体分别对狂犬病毒的增殖以及细胞趋化活性有明显抑制作用。随后将双特异适配体与RVG29-9R-His共同孵育结合,将该复合物经尾静脉注射入攻毒小鼠体内,可见该小鼠较未注射药物的小鼠生存期有所延长。本研究成功筛选出CCL5蛋白核酸适配体,并以细胞迁移实验验证其活性,证实该适配体具有抑制CCL5蛋白趋化活性的功能。后成功纯化出RVG29-9RHis药物运输载体,并通过凝胶阻滞实验验证其具有结合核酸片段的能力,通过细胞ELISA实验验证其具有特异性结合神经细胞的能力。L蛋白与CCL5蛋白核酸适配体通过末端加入的一段互补连接序列组装为双特异性核酸适配体,以静电作用与RVG29-9R-His聚合,对小鼠进行尾静脉药物注射和攻毒实验。结果证实本研究获得了具有一定抗狂犬病毒活性的双特异核酸适配体药物,该药物为治疗狂犬病提供了一种新途径。