论文部分内容阅读
目的：探讨内质网应激(ERS)在硫化氢(H2S)调节脂多糖(LPS)诱导肝细胞凋亡中的作用；初步研究外源性H2S调节LPS诱导肝细胞ERS的分子机制。方法：大鼠肝细胞系BRL细胞培养，用LPS、ERS诱导剂毒胡萝卜素(TG)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)分别或组合处理BRL细胞；用小干扰RNA(siRNA)技术沉默H2S生成酶胱硫醚-β-合酶(CBS)及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)表达，H2S供体硫氢化钠(NaHS)与LPS共同处理肝细胞；分别用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、KATP通道抑制剂格列苯脲(Gli)预处理细胞，再观察NaHS与LPS的作用。用去蛋白法检测细胞H2S含量；用MTT比色法或台盼蓝拒染法检测细胞活力；用Hoechst33258荧光染色确证细胞凋亡；用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；用Western blot检测ERS标志蛋白GRP78和ERS凋亡相关蛋白CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白表达。结果：与溶剂对照组比较，LPS可剂量和时间依赖性引起肝细胞活力显著降低、细胞凋亡率明显增加，诱导GRP78以及CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白表达上调；TG本身可引起肝细胞活力降低和细胞凋亡增加，能显著加重LPS引起的肝细胞损伤；4-PBA可起细胞凋亡少量但明显增加，明显抑制了LPS引起的肝细胞凋亡增加；CBS siRNA、CSE siRNA能显著抑制静息肝细胞和LPS引起肝细胞内源性H2S生成，并抑制LPS引起肝细胞活力降低、细胞凋亡增加，翻转了LPS引起GRP78和CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白表达上调；NAC预处理能明显降低LPS引起的细胞活力降低、凋亡增加以及GRP78和CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白表达上调，与NaHS共同作用具有协同效应；Gli预处理能明显促进LPS引起的细胞活力降低、凋亡增加以及GRP78和CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白表达上调，部分阻断NaHS对LPS引起ERS的拮抗作用。结论：LPS通过引起氧化应激而诱导肝细胞ERS，ERS参与介导LPS诱导的肝细胞凋亡；在本实验条件下，内源性H2S上调、外源性H2S抑制LPS引起的肝细胞ERS，从而调节LPS诱导的肝细胞凋亡变化；外源性H2S通过增强抗氧化效应、开放KATP通道抑制LPS引起的ERS上调，从而减少了LPS诱导的肝细胞凋亡增加；内、外源性H2S对LPS诱导肝细胞ERS的调节作用迥异，其机制有待进一步研究。