亚高温盆腔区域热疗联合HSP70-PC治疗浸润性膀胱肿瘤的实验研究为探讨亚高温盆腔区域热疗治疗浸润性膀胱肿瘤的机理，以及热休克蛋白70-肽复合物（HSP70-PC）治疗浸润性膀胱肿瘤的机理，进一步探索该两种方法联合治疗的效果和机理，本研究进行了六部分实验：①亚高温盆腔区域热疗诱导原位大鼠浸润性膀胱肿瘤HSP70表达的研究：制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型，用内生场热疗仪从体外加热大鼠盆腔，温度升至41℃，用免疫电镜、光镜、蛋白芯片飞行时间质谱技术研究不同热疗方案下肿瘤组织HSP70的表达规律。②大鼠膀胱肿瘤HSP70-PC的纯化研究：用改良的液相色谱三步法从大鼠膀胱肿瘤组织中分离纯化HSP70-PC。③同种肿瘤来源的HSP70-PC对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的治疗研究：将HSP70-PC用于治疗相同品系的肿瘤鼠，观察疗效。本实验首次研究探讨了HSP70-PC对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的治疗效果和作用机制。④亚高温盆腔区域热疗对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤形态学影响的研究：对不同方案和疗程的亚高温盆腔区域热疗后肿瘤形态学改变进行病理研究。⑤亚高温盆腔区域热疗对浸润性膀胱肿瘤大鼠免疫状态影响的研究：对不同方案和疗程的亚高温盆腔区域热疗后肿瘤鼠免疫状态的改变进行病理和ELISA研究。⑥亚高温盆腔区域热疗联合HSP70-PC治疗原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的研究：将亚高温盆腔区域热疗与皮下注射HSP70-PC序贯治疗浸润性膀胱肿瘤大鼠一个月，观察疗效，初步阐释联合治疗的机理。第一部分亚高温盆腔区域热疗诱导原位大鼠浸润性膀胱肿瘤HSP70表达的研究目的研究不同热疗方案的亚高温盆腔区域热疗诱导原位大鼠浸润性膀胱肿瘤发生热休克反应后HSP70的表达规律。方法经尿道膀胱灌注MNU制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型。分为肿瘤对照组（A组）、单次热疗组（B组）、间隔24小时再次热疗组（C组）、间隔72小时再次热疗组（D组）。用内生场热疗系统从体外加热大鼠盆腔至41℃，持续1小时。用胶体金免疫电镜技术检测HSP70在肿瘤细胞中表达的部位，免疫组织化学法检测肿瘤细胞HSP70阳性细胞表达率，并用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术检测肿瘤组织匀浆上清液中HSP70表达量（HSP70 Intensity和HSP70 MZ Area）的变化。结果A组HSP70定位于肿瘤细胞质，B、C、D组HSP70均定位于肿瘤细胞核、线粒体和细胞质。B、C、D组HSP70阳性细胞表达率均高于A组，差异有统计学意义（P＜0.01），但B、C、D组间差异无统计学意义（P=0.101）。B、C、D组HSP70表达量均高于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。C、D组HSP70表达量均高于单次热疗组，差异有统计学意义（P＜0.01）。C组HSP70表达量高于D组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论不同方案的亚高温盆腔区域热疗均能诱导原位大鼠浸润性膀胱肿瘤发生热休克反应，上调HSP70表达。亚高温盆腔区域热疗是一种温和的加热方法，它不能使全部肿瘤细胞发生热休克反应。HSP70表达率不与热疗次数成正相关，但表达量与热疗次数成正相关。间隔24小时再次热疗组的HSP70表达量最高。第二部分大鼠膀胱肿瘤HSP70-PC的纯化研究目的分离纯化经亚高温盆腔区域热疗处理后大鼠膀胱肿瘤组织中的热休克蛋白70-肽复合物（HSP70-PC）。方法经尿道膀胱灌注MNU制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤，用内生场热疗系统加热大鼠盆腔，用改良的液相色谱三步法从大鼠膀胱肿瘤组织中分离纯化HSP70-PC，用SDS-PAGE、Western blotting、表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）鉴定纯化的HSP70-PC及与其结合的多肽。结果应用我们改良的液相色谱三步法纯化获得的蛋白质经SDS-PAGE、Western blotting、SELDI-TOF-MS鉴定，证实其为结合有多肽的HSP70-PC。结论应用我们改良的液相色谱三步法可以纯化获得高纯度的HSP70-PC。第三部分同种肿瘤来源的HSP70-PC对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的治疗研究目的研究用来自亚高温盆腔区域热疗后原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的热休克蛋白70-肽复合物（HSP70-PC）对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的治疗机制。方法将HSP70-PC用于治疗相同品系的肿瘤鼠，观察疗效。经尿道膀胱灌注MNU制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型。将动物随机分为A（肿瘤对照）组、B（HSP70-PC治疗）组、C（肿瘤细胞裂解液治疗）组，每组5只。皮下注射治疗一月后对膀胱肿瘤、膀胱引流区域髂动脉及腹主动脉旁淋巴结、脾脏进行病理研究，ELISA检测血清Rat IFN-γ含量。结果膀胱及肿瘤湿重B组低于A、C组，差异有统计学意义（P＜0.01）。A、C组间差异无统计学意义（P=0.610）。B组肿瘤分期低于A、C组，差异有统计学意义（P＜0.01）；A、C组间差异无统计学意义（P=1）。肿瘤分级各组间差异均无统计学意义（P=1）。B组肿瘤细胞AI、膀胱肿瘤组织中CD₈阳性细胞率、血清Rat IFN-γ含量均高于A、C组，差异有统计学意义（P＜0.01）；A、C组间三指标差异均无统计学意义（P=0.870，0.597，0.979）。脾脏S-100蛋白阳性细胞率、CD₈阳性细胞率由高到低均为B、C、A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。肿瘤细胞PCNALI、膀胱肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率、淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率三组之间差异均无统计学意义（P=0.808，0.718，0.847）。结论皮下注射HSP70-PC可以上调原位浸润性膀胱肿瘤大鼠的细胞免疫状态，促进肿瘤细胞凋亡，但对肿瘤细胞增殖无影响。第四部分亚高温盆腔区域热疗对原位大鼠浸润性膀胱肿瘤形态学影响的研究目的对不同方案和疗程的亚高温盆腔区域热疗后浸润性膀胱肿瘤形态学改变进行病理研究。方法制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型，分为短期组和长期组。用内生场热疗系统从体外加热大鼠盆腔至41℃，不同组别热疗次数及疗程不同。短期组中分为肿瘤对照组（A组）、单次热疗组（B组）、间隔24小时再次热疗组（C组）、间隔72小时再次热疗组（D组）。长期组中分为肿瘤对照组（E组）、间隔24小时再次热疗组（F组）、间隔72小时再次热疗组（G组），治疗4周。热疗后对肿瘤进行病理研究。结果短期组膀胱及肿瘤湿重由高到低为A、D、C组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01），但A、B组间差异无统计学意义（P=0.737）；长期组由高到低为E、G、F组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。肿瘤分期和分级在短期组和长期组中各组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。电镜观察短期组中的热疗组均有早期凋亡细胞出现；长期组中的热疗组凋亡细胞和凋亡小体多见。短期组中B、C、D组的肿瘤细胞HSP70表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；但B、C、D组间差异无统计学意义（P=0.101）。长期组中热疗组的肿瘤细胞HSP70表达率由高到低为F、G、E组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。短期组PCNA LI由高到低为A、B、D、C组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）；AI由高到低为C、D、B、A组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。长期组PCNA LI由高到低为E、G、F组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）；AI由高到低为F、G、E组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论亚高温盆腔区域热疗可抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，长期的间歇热疗未导致肿瘤细胞出现热耐受。第五部分亚高温盆腔区域热疗对浸润性膀胱肿瘤大鼠免疫状态影响的研究目的研究不同方案和疗程的亚高温盆腔区域热疗使原位大鼠浸润性膀胱肿瘤发生热休克反应后机体免疫状态的改变。方法制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型，分为短期组和长期组。用内生场热疗系统从体外加热大鼠盆腔至41℃。对不同方案及不同疗程的亚高温盆腔区域热疗后肿瘤鼠免疫状态的改变进行病理，ELISA检测血清Rat IFN-γ含量。结果透射电镜观察到短期组中B（单次热疗组）、C（间隔24小时再次热疗组）、D（间隔72小时再次热疗组）组肿瘤组织中有较多中性粒细胞、巨噬细胞；长期组中F（间隔24小时再次热疗组）、G（间隔72小时再次热疗组）组中性粒细胞聚集，巨噬细胞吞噬凋亡小体。短期组中组膀胱肿瘤组织中、淋巴结中、脾脏中S-100蛋白阳性细胞率由高到低均为C、D、B、A（肿瘤对照组）组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。短期组中膀胱肿瘤组织中CD₈阳性细胞率、脾脏CD₈阳性细胞率、血清Rat IFN-γ含量A、B、C、D组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。长期组中各项指标由高到低均为F、G、E（肿瘤对照组）组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论随着亚高温盆腔区域热疗次数的增加，肿瘤鼠的免疫细胞重新分布，有利于肿瘤抗原递呈及效应细胞攻击肿瘤。第六部分亚高温盆腔区域热疗联合HSP70-PC治疗原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的研究目的观察亚高温盆腔区域热疗联合皮下注射HSP70-PC治疗大鼠浸润性膀胱肿瘤的疗效，初步阐释联合治疗的机理。方法制备原位大鼠浸润性膀胱肿瘤动物模型，分为A（肿瘤对照组）、B（热疗组）、C（HSP70-PC治疗组）、D（联合治疗组）四组。用内生场热疗系统从体外加热大鼠盆腔至41℃。将亚高温盆腔区域热疗与皮下注射HSP70-PC序贯治疗一个月后对肿瘤、引流淋巴结、脾脏进行病理研究，检测血清Rat IFN-γ含量。结果D组透射电镜下肿瘤组织中凋亡细胞和凋亡小体多见，有较多淋巴细胞、中性粒细胞聚集成团、巨噬细胞吞噬凋亡小体。D组膀胱及肿瘤湿重、肿瘤分期、肿瘤细胞PCNA LI均低于A、B、C组，组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。肿瘤分级各组间差异均无统计学意义（P=1）。D组肿瘤细胞HSP70表达率、肿瘤组织中S-100蛋白阳性细胞率高于C组（P＜0.01）；但与B组差异无统计学意义（P=0.825，0.686）。D组肿瘤细胞凋亡指数、膀胱肿瘤组织中CD₈阳性细胞率、淋巴结中S-100蛋白阳性细胞率、脾脏S-100蛋白阳性细胞率、脾脏CD₈阳性细胞率、血清Rat IFN-γ含量均高于A、B、C组（P＜0.01）。结论亚高温盆腔区域热疗产生的促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、上调免疫状态的作用，与HSP70-PC诱发的抗肿瘤免疫效应具有协同互补作用和叠加效应。亚高温盆腔区域热疗联合HSP70-PC治疗原位大鼠浸润性膀胱肿瘤的新方法的疗效高于单独的疗法。