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硒是机体必需的微量营养元素，在抗氧化、抗病毒、提高机体免疫力等方面起着重要的作用。硒代蛋氨酸(Se-Met)是生物利用效率最高的有机硒化合物，研究表明，补充适量的Se-Met可促进动物的生长性能和养分利用效率、提高抗氧化能力。猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是近年新发现的一种能够引起猪只严重水样腹泻和新生仔猪死亡的猪肠道冠状病毒。该病毒主要侵害猪的小肠部位，引起肠道上皮细胞坏死，造成小肠绒毛萎缩和脱落，降低饲料的消化和吸收，进而导致腹泻，严重影响养猪业的健康发展。目前已有研究报道，猪肠道冠状病毒感染所致的肠道损伤与氧化应激有关，但其具体机制不清楚。因此，本论文通过研究Se-Met对PDCoV人工感染仔猪的生长性能、饲料养分表观消化率、抗氧化能力和肠道屏障损伤的影响，探讨Se-Met缓解PDCoV感染引起的仔猪肠道氧化应激、保护仔猪肠道屏障的作用;同时，以PDCoV体外感染细胞为模型，研究Se-Met对PDCoV复制的影响及潜在的调节机制，为开发营养抗病毒饲料添加剂提供理论基础。
1.Se-Met对PDCoV感染仔猪生长性能和抗氧化能力的影响研究
试验选取12头8日龄健康“杜×长×大”仔猪(2.47±0.15Kg)，随机分成四组:对照组(基础饲粮组)、Se-Met组(基础饲粮组+0.3mg/kg硒)、PDCoV组(基础饲粮组)和Se-Met+PDCoV组(基础饲粮+0.3mg/kg硒)，每组3头。预试期3d，正试期21d。在正试期第14d，PDCoV组和Se-Met+PDCoV组的仔猪口服PDCoV培养液(109 TCID50/mL)，对照组和Se-Met组的仔猪口服细胞培养液。在试验期间，每天观察仔猪的临床症状，并记录仔猪采食量、体重和腹泻情况，测定仔猪肠道双糖酶和抗氧化酶活性、粪便和组织中的病毒含量。结果表明:
与对照组相比，Se-Met组仔猪的平均日增重(ADG)及粗蛋白和钙、磷的养分表观消化率显著提高(P＜0.05)，仔猪空肠中麦芽糖酶、乳糖酶和回肠中蔗糖酶的活性及空肠、回肠和血清中谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)的活性显著提高(P＜0.05)。此外，与PDCoV组相比，Se-Met+PDCoV组仔猪的ADG、平均日采食量(ADFI)、饲料养分表观消化率(粗蛋白、粗脂肪、钙和磷)、肠道双糖酶活性以及肠道和血清中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-PX的活性显著升高(P＜0.05)，料重比(F/G)降低(P＜0.05)(试验的14-21d)。另外，Se-Met的补充缓解了PDCoV感染引起的仔猪腹泻，缩短了排毒时间，降低了PDCoV在肠道组织中的病毒载量。这些结果表明，Se-Met的补充可改善PDCoV感染仔猪的生长性能、饲料养分表观消化率、肠道双糖酶活性和抗氧化能力，提高仔猪抗PDCoV感染的作用。
2.Se-Met对PDCoV感染引起的仔猪肠道屏障损伤的研究
在明确Se-Met可改善PDCoV感染仔猪抗氧化能力的基础上，本部分试验进一步探讨Se-Met对PDCoV感染引起的仔猪肠道氧化应激损伤的影响。按照试验一设计动物试验，在试验结束，剖杀仔猪后，收集空肠和回肠的黏液来测定仔猪肠道的黏液性质，对仔猪肠道组织进行形态学和组织病理学观察;收集血清，评估仔猪肠道通透性;并对空肠和回肠组织中凋亡酶的活性及肠道紧密连接蛋白基因和凋亡相关基因的水平进行检测。结果显示，饲粮中Se-Met的补充提高了感染和未感染仔猪空肠和回肠黏液的黏度，及黏液的弹性模量(G′)和黏性模量(G″)，表明Se-Met的添加可改善仔猪肠道黏液的特性。与PDCoV组相比，Se-Met+PDCoV组仔猪肠道的组织病理损伤明显减轻，且肠道黏膜形态得到显著改善，仔猪血清中D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平显著降低(P＜0.05)，仔猪空肠和回肠紧密连接蛋白因子(ZO-1和Occludin)的表达水平显著升高(P＜0.05)，表明Se-Met的添加可改善PDCoV感染仔猪引起的肠道屏障功能损伤;Se-Met+PDCoV组仔猪空肠和回肠中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10)的表达水平显著降低(P＜0.05)，表明Se-Met的添加减轻了PDCoV感染引起的炎症性损伤;在肠道细胞凋亡方面，Se-Met+PDCoV组仔猪空肠和回肠细胞中Caspase3、Caspase9的活性及凋亡因子(Bax、Cascase3、Cascase9)的表达水平显著降低(P＜0.05)，而抗凋亡(Bcl2)因子的表达水平显著升高(P＜0.05)，表明Se-Met的添加降低了PDCoV感染仔猪引起的肠道细胞凋亡。此外，与对照组相比，Se-Met组仔猪空肠和回肠中的Bcl2因子的表达水平也显著升高(P＜0.05)。这些结果表明，Se-Met可改善仔猪肠道黏液的特性和肠道屏障功能，降低肠道炎症反应，抑制肠细胞凋亡，保护仔猪肠道黏膜屏障的完整性。
3.Se-Met对PDCoV感染仔猪肠道微生物和短链脂肪酸影响的研究
为了解Se-Met对PDCoV感染仔猪肠道微生物和短链脂肪酸影响，在试验结束后，收集仔猪结肠内容物，提取总DNA，然后使用IlluminaMiSeq系统进行16SrRNA测序，研究仔猪结肠微生物的多样性;并采用高效液相色谱法测定仔猪结肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs，包括乙酸、丙酸和丁酸)的含量。结果表明，Se-Met组和对照组之间仔猪的肠道微生物和SCFAs含量无显著差异(P＞0.05)。与PDCoV组相比较，Se-Met+PDCoV组仔猪结肠的红椿菌科(Coriobacteriaceae)、Subdoligranulum(属)和普雷沃氏菌属UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)的相对丰度显著提高(P＜0.05)，仔猪的普雷沃氏菌NK3B31科类群(Prevotellaceae_NK3B31_group)和普雷沃氏菌属2(Prevotella_2)的相对丰度显著降低(P＜0.05);Se-Met+PDCoV组仔猪结肠中乙酸、丙酸和丁酸的含量显著升高(P＜0.05);对仔猪肠道微生物与SCFAs的相关性分析表明，肠道菌群的变化与其代谢产物变化存在一定的相关性。这些结果表明，Se-Met可调节PDCoV感染仔猪的肠道微生物的平衡，提高SCFAs的含量，促进仔猪肠道稳态和能量代谢。
4.Se-Met抑制PDCoV感染的作用及机制研究
我们前期的试验结果表明，Se-Met可抑制PDCoV感染引起的仔猪肠道屏障损伤，其中细胞凋亡与PDCoV的致病机理密切有关。为了研究Se-Met对PDCoV感染引起的细胞凋亡的保护作用，我们应用PDCoV最适细胞系ST细胞为模型。首先通过MTT试验确定了Se-Met在ST细胞上的最大安全浓度。用不同浓度的Se-Met预处理ST细胞24h后，PDCoV(MOI=1)感染细胞，然后与不同浓度Se-Met共同孵育24h，分析Se-Met对PDCoV复制的影响。结果表明，Se-Met对PDCoV在ST细胞中的复制有一定的抑制作用，其抑制作用与Se-Met浓度呈剂量依赖性。接下来，用不同浓度的Se-Met预处理ST细胞24h后，PDCoV(MOI=0.1)感染细胞，然后与不同浓度Se-Met共同孵育24h，通过检测细胞凋亡指标(Caspase3、Caspase9活性和细胞凋亡率)、氧化应激指标(ROS、GSH-PX、SOD和MDA)、Nrf2和HO-1基因和蛋白的表达，分析Se-Met抑制PDCoV感染引起的细胞凋亡的作用及可能机制。结果显示，在PDCoV感染的细胞中，添加Se-Met可显著降低Caspase3和Caspase9活性，显著抑制细胞凋亡，并呈现剂量依赖性，提示Se-Met对PDCoV引起的细胞凋亡有显著的保护作用。通过使用抗氧化剂N乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理细胞发现，与PDCoV组相比，NAC+PDCoV组Caspase3和Casepase9的活性显著降低(P＜0.01)，并使细胞凋亡率显著下降(P＜0.01)，表明PDCoV感染引起的细胞凋亡与氧化应激有关。同时，Se-Met可显著提高SOD、GSH-PX的活性，显著降低PDCoV感染引起的细胞内活性氧(ROS)和MDA含量，并呈剂量依赖性，证明Se-Met对PDCoV引起凋亡的保护作用与其抗氧化能力有关。与PDCoV组相比较，Se-Met+PDCoV组可显著提高Nrf2及其下游HO-1基因和蛋白的表达(P＜0.05)，表明Se-Met可能通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。我们利用Nrf2抑制剂(ML385)处理细胞后，显著降低了感染或未感染组细胞中的Nrf2和HO-1基因和蛋白的表达也显著降低(P＜0.05)。并发现，ML385减弱了Se-Met对PDCoV引起凋亡及抵抗ROS产生的保护作用，提示Nrf2在Se-Met保护PDCoV引起ST细胞凋亡的过程中起着关键性的作用。这些结果表明，Se-Met可抑制PDCoV在ST细胞上的复制，Se-Met可通过激活Nrf2信号途径减轻PDCoV引起的凋亡，在这个过程中，Nrf2起着至关重要的作用。
综合以上研究结果，表明Se-Met可改善PDCoV感染仔猪的生产性能和抗氧化能力，缓解PDCoV感染引起的仔猪腹泻，抑制病毒复制，其作用机制可能是通过激活Nrf2信号途径，提高仔猪肠道抗氧化酶的活性，抑制肠细胞凋亡，进而保护了肠黏膜屏障的完整性，最终降低腹泻的发生。本研究为仔猪饲粮中添加Se-Met缓解PDCoV感染仔猪腹泻提供了科学依据。
1.Se-Met对PDCoV感染仔猪生长性能和抗氧化能力的影响研究
试验选取12头8日龄健康“杜×长×大”仔猪(2.47±0.15Kg)，随机分成四组:对照组(基础饲粮组)、Se-Met组(基础饲粮组+0.3mg/kg硒)、PDCoV组(基础饲粮组)和Se-Met+PDCoV组(基础饲粮+0.3mg/kg硒)，每组3头。预试期3d，正试期21d。在正试期第14d，PDCoV组和Se-Met+PDCoV组的仔猪口服PDCoV培养液(109 TCID50/mL)，对照组和Se-Met组的仔猪口服细胞培养液。在试验期间，每天观察仔猪的临床症状，并记录仔猪采食量、体重和腹泻情况，测定仔猪肠道双糖酶和抗氧化酶活性、粪便和组织中的病毒含量。结果表明:
与对照组相比，Se-Met组仔猪的平均日增重(ADG)及粗蛋白和钙、磷的养分表观消化率显著提高(P＜0.05)，仔猪空肠中麦芽糖酶、乳糖酶和回肠中蔗糖酶的活性及空肠、回肠和血清中谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)的活性显著提高(P＜0.05)。此外，与PDCoV组相比，Se-Met+PDCoV组仔猪的ADG、平均日采食量(ADFI)、饲料养分表观消化率(粗蛋白、粗脂肪、钙和磷)、肠道双糖酶活性以及肠道和血清中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-PX的活性显著升高(P＜0.05)，料重比(F/G)降低(P＜0.05)(试验的14-21d)。另外，Se-Met的补充缓解了PDCoV感染引起的仔猪腹泻，缩短了排毒时间，降低了PDCoV在肠道组织中的病毒载量。这些结果表明，Se-Met的补充可改善PDCoV感染仔猪的生长性能、饲料养分表观消化率、肠道双糖酶活性和抗氧化能力，提高仔猪抗PDCoV感染的作用。
2.Se-Met对PDCoV感染引起的仔猪肠道屏障损伤的研究
在明确Se-Met可改善PDCoV感染仔猪抗氧化能力的基础上，本部分试验进一步探讨Se-Met对PDCoV感染引起的仔猪肠道氧化应激损伤的影响。按照试验一设计动物试验，在试验结束，剖杀仔猪后，收集空肠和回肠的黏液来测定仔猪肠道的黏液性质，对仔猪肠道组织进行形态学和组织病理学观察;收集血清，评估仔猪肠道通透性;并对空肠和回肠组织中凋亡酶的活性及肠道紧密连接蛋白基因和凋亡相关基因的水平进行检测。结果显示，饲粮中Se-Met的补充提高了感染和未感染仔猪空肠和回肠黏液的黏度，及黏液的弹性模量(G′)和黏性模量(G″)，表明Se-Met的添加可改善仔猪肠道黏液的特性。与PDCoV组相比，Se-Met+PDCoV组仔猪肠道的组织病理损伤明显减轻，且肠道黏膜形态得到显著改善，仔猪血清中D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平显著降低(P＜0.05)，仔猪空肠和回肠紧密连接蛋白因子(ZO-1和Occludin)的表达水平显著升高(P＜0.05)，表明Se-Met的添加可改善PDCoV感染仔猪引起的肠道屏障功能损伤;Se-Met+PDCoV组仔猪空肠和回肠中炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10)的表达水平显著降低(P＜0.05)，表明Se-Met的添加减轻了PDCoV感染引起的炎症性损伤;在肠道细胞凋亡方面，Se-Met+PDCoV组仔猪空肠和回肠细胞中Caspase3、Caspase9的活性及凋亡因子(Bax、Cascase3、Cascase9)的表达水平显著降低(P＜0.05)，而抗凋亡(Bcl2)因子的表达水平显著升高(P＜0.05)，表明Se-Met的添加降低了PDCoV感染仔猪引起的肠道细胞凋亡。此外，与对照组相比，Se-Met组仔猪空肠和回肠中的Bcl2因子的表达水平也显著升高(P＜0.05)。这些结果表明，Se-Met可改善仔猪肠道黏液的特性和肠道屏障功能，降低肠道炎症反应，抑制肠细胞凋亡，保护仔猪肠道黏膜屏障的完整性。
3.Se-Met对PDCoV感染仔猪肠道微生物和短链脂肪酸影响的研究
为了解Se-Met对PDCoV感染仔猪肠道微生物和短链脂肪酸影响，在试验结束后，收集仔猪结肠内容物，提取总DNA，然后使用IlluminaMiSeq系统进行16SrRNA测序，研究仔猪结肠微生物的多样性;并采用高效液相色谱法测定仔猪结肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs，包括乙酸、丙酸和丁酸)的含量。结果表明，Se-Met组和对照组之间仔猪的肠道微生物和SCFAs含量无显著差异(P＞0.05)。与PDCoV组相比较，Se-Met+PDCoV组仔猪结肠的红椿菌科(Coriobacteriaceae)、Subdoligranulum(属)和普雷沃氏菌属UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)的相对丰度显著提高(P＜0.05)，仔猪的普雷沃氏菌NK3B31科类群(Prevotellaceae_NK3B31_group)和普雷沃氏菌属2(Prevotella_2)的相对丰度显著降低(P＜0.05);Se-Met+PDCoV组仔猪结肠中乙酸、丙酸和丁酸的含量显著升高(P＜0.05);对仔猪肠道微生物与SCFAs的相关性分析表明，肠道菌群的变化与其代谢产物变化存在一定的相关性。这些结果表明，Se-Met可调节PDCoV感染仔猪的肠道微生物的平衡，提高SCFAs的含量，促进仔猪肠道稳态和能量代谢。
4.Se-Met抑制PDCoV感染的作用及机制研究
我们前期的试验结果表明，Se-Met可抑制PDCoV感染引起的仔猪肠道屏障损伤，其中细胞凋亡与PDCoV的致病机理密切有关。为了研究Se-Met对PDCoV感染引起的细胞凋亡的保护作用，我们应用PDCoV最适细胞系ST细胞为模型。首先通过MTT试验确定了Se-Met在ST细胞上的最大安全浓度。用不同浓度的Se-Met预处理ST细胞24h后，PDCoV(MOI=1)感染细胞，然后与不同浓度Se-Met共同孵育24h，分析Se-Met对PDCoV复制的影响。结果表明，Se-Met对PDCoV在ST细胞中的复制有一定的抑制作用，其抑制作用与Se-Met浓度呈剂量依赖性。接下来，用不同浓度的Se-Met预处理ST细胞24h后，PDCoV(MOI=0.1)感染细胞，然后与不同浓度Se-Met共同孵育24h，通过检测细胞凋亡指标(Caspase3、Caspase9活性和细胞凋亡率)、氧化应激指标(ROS、GSH-PX、SOD和MDA)、Nrf2和HO-1基因和蛋白的表达，分析Se-Met抑制PDCoV感染引起的细胞凋亡的作用及可能机制。结果显示，在PDCoV感染的细胞中，添加Se-Met可显著降低Caspase3和Caspase9活性，显著抑制细胞凋亡，并呈现剂量依赖性，提示Se-Met对PDCoV引起的细胞凋亡有显著的保护作用。通过使用抗氧化剂N乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理细胞发现，与PDCoV组相比，NAC+PDCoV组Caspase3和Casepase9的活性显著降低(P＜0.01)，并使细胞凋亡率显著下降(P＜0.01)，表明PDCoV感染引起的细胞凋亡与氧化应激有关。同时，Se-Met可显著提高SOD、GSH-PX的活性，显著降低PDCoV感染引起的细胞内活性氧(ROS)和MDA含量，并呈剂量依赖性，证明Se-Met对PDCoV引起凋亡的保护作用与其抗氧化能力有关。与PDCoV组相比较，Se-Met+PDCoV组可显著提高Nrf2及其下游HO-1基因和蛋白的表达(P＜0.05)，表明Se-Met可能通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。我们利用Nrf2抑制剂(ML385)处理细胞后，显著降低了感染或未感染组细胞中的Nrf2和HO-1基因和蛋白的表达也显著降低(P＜0.05)。并发现，ML385减弱了Se-Met对PDCoV引起凋亡及抵抗ROS产生的保护作用，提示Nrf2在Se-Met保护PDCoV引起ST细胞凋亡的过程中起着关键性的作用。这些结果表明，Se-Met可抑制PDCoV在ST细胞上的复制，Se-Met可通过激活Nrf2信号途径减轻PDCoV引起的凋亡，在这个过程中，Nrf2起着至关重要的作用。
综合以上研究结果，表明Se-Met可改善PDCoV感染仔猪的生产性能和抗氧化能力，缓解PDCoV感染引起的仔猪腹泻，抑制病毒复制，其作用机制可能是通过激活Nrf2信号途径，提高仔猪肠道抗氧化酶的活性，抑制肠细胞凋亡，进而保护了肠黏膜屏障的完整性，最终降低腹泻的发生。本研究为仔猪饲粮中添加Se-Met缓解PDCoV感染仔猪腹泻提供了科学依据。