前言：　　 大量研究证明大蒜成分具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗菌等活性。其抗肿瘤机制大致包括阻滞细胞周期、诱导凋亡、抑制血管生成和肿瘤转移等。　　 黑大蒜是一种新型大蒜加工产品,由新鲜大蒜经过一定的温度和湿度处理而制成,与新鲜大蒜相比,其S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine,SAC)含量明显升高,且无刺激性气味,可直接食用。有研究显示黑大蒜乙醇提取物的体外免疫刺激活性(主要包括促进人淋巴细胞增殖和巨噬细胞分泌NO、TNF-α以及抗肿瘤作用和自由基清除能力)均强于新鲜大蒜乙醇提取物。有关黑大蒜对固有免疫细胞抗肿瘤活性影响的报道极少且其抗肿瘤机制尚未明确,本实验室在证明黑大蒜提取物能够显著增强正常小鼠NK细胞杀伤活性,提高NO水平,以及增强Tb1型细胞免疫应答的基础上,应用自制的黑大蒜提取物溶液,以小鼠成纤维肉瘤细胞MethA异位移植小鼠以及纤维肉瘤细胞系为研究对象,研究黑大蒜提取物对固有免疫细胞抗肿瘤活性的影响及其抗肿瘤机制,为黑大蒜的抗肿瘤应用进一步提供实验依据。　　 实验材料：　　 1、主要试剂　　 黑大蒜提取物粉末,红细胞裂解液,胰蛋白酶,RPMI1640培养液,标准胎牛血清,0.01MPBS缓冲液,生理盐水,小鼠中性粒细胞分离液,碘化丙啶,LDH底物液,Griess试剂,牡蛎糖原,双氯荧光黄乙酸乙酯(2,7-Dichlorofluorescindiacetate,DCFH-DA),羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE,CellTiter96(R)AQueousNon-RadioactiveCellProliferationAssay,AnnexinV-FITCApoptosisDetection.Kit等。　　 2、实验细胞系及动物　　 雌性BALB/c小鼠,6～8周龄,SPF级,购自中科院上海实验动物中心。　　 小鼠成纤维肉瘤细胞MethA,小鼠纤维肉瘤细胞L929,小鼠成纤维细胞.3T3,小鼠T淋巴瘤细胞Yac-1。　　 实验方法：　　 1、实验分组及处理　　 (1)观察黑大蒜提取物对正常小鼠中性粒细胞抗肿瘤活性的影响　　 雌性BALB/c小鼠随机分为4个实验组和1个对照组,每组5只。给予实验组每天腹腔注射100μl黑大蒜提取物溶液(1mg/ml,对照组每天腹腔注射100μl生理盐水。连续注射5天。实验组小鼠分别于末次注射后的第1、3、5、7天提取腹腔中性粒细胞,对照组小鼠在末次注射后第7天处死。　　 (2)观察黑大蒜提取物对荷瘤小鼠生存率的影响　　 雌性BALB/c小鼠随机分为黑大蒜组和荷瘤对照组,每组6只。每只小鼠右侧背部皮下接种4×106个MethA细胞,成瘤率100%。在接种肿瘤的第7天,给予黑大蒜组小鼠每天腹腔注射200μl浓度为10mg/ml的黑大蒜提取物溶液,荷瘤对照组每天腹腔注射200μl的生理盐水,连续注射7天。此后常规饲养,记录小鼠存活情况。　　 (3)观察黑大蒜提取物对荷瘤小鼠中性粒细胞ROS产生水平、NK细胞杀伤活性及脾细胞培养上清NO水平的影响　　 雌性BALB/c小鼠随机分为黑大蒜组、荷瘤对照组和空白对照组,每组10只。空白对照组不予处理。其余小鼠右侧背部皮下均接种1×106个MethA细胞,成瘤率100%。在接种肿瘤的第7天,给予黑大蒜组小鼠每天腹腔注射200μl浓度为10mg/ml的黑大蒜提取物溶液,荷瘤对照组每天腹腔注射200μ1的生理盐水,连续注射7天。于末次注射后第4天处死。每组各取5只小鼠用于提取腹腔中性粒细胞,剩余小鼠用于制备脾细胞悬液。　　 (4)观察不同浓度黑大蒜提取物对细胞的增殖抑制的影响　　 将MethA细胞、L929细胞和3T3细胞分别与不同浓度黑大蒜提取物溶液(0mg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg,ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml和5mg/ml)共同孵育24小时。用于MTS法检测黑大蒜提取物对细胞的增殖抑制作用。　　 (5)观察黑大蒜提取物对MethA细胞周期及细胞凋亡的影响　　 用4mg/ml黑大蒜提取物溶液或者RPMI1640培养液分别处理MethA细胞24小时,检测MethA细胞周期及细胞凋亡情况。　　 2、样品的采集与检测分析　　 (1)小鼠腹腔中性粒细胞提取及悬液的制备　　 小鼠腹腔注射1%牡蛎糖原1.5ml,4小时后处死小鼠,常规无菌收集腹腔灌洗液,经中性粒细胞分离液分离纯化后,调整细胞浓度至1×106/ml。　　 (2)DCFH-DA染色法检测中性粒细胞ROS产生水平　　 (3)CFSE标记法检测中性粒细胞杀伤作用　　 (4)记录荷瘤小鼠存活情况　　 (5)脾细胞分离及其悬液的制备　　 颈椎脱位法处死小鼠,常规制备脾细胞悬液,调整细胞浓度至1×107/ml。　　 (6)LDH释放法检测NK细胞的杀伤活性　　 (7)Griess法检测脾细胞培养上清中NO水平　　 (8)MTS法检测MethA、L929和3T3细胞增殖抑制情况　　 (9)PI染色法检测MethA细胞周期　　 (10)AnnexinV-FITC.ApoptosisDetectionKit检测MethA细胞凋亡　　 (11)统计学处理　　 实验数据应用SPSS16.0统计分析软件,经方差分析和t检验方法进行统计处理,P＜0.05有显著性差异。　　 结果：　　 1、黑大蒜提取物对正常小鼠中性粒细胞ROS产生水平的影响　　 与对照组(337.46±32.25)相比,黑大蒜提取物处理后第3～7天,正常小鼠ROS水平明显降低(P＜0.01),并在第5天降到最低(244.34±15.60)。　　 2、黑大蒜提取物对正常小鼠中性粒细胞杀伤作用的影响　　 各实验组中性粒细胞杀伤率与对照组(5.16±3.55%)相比均未见显著性差异(P＞0.05)。　　 3、黑大蒜提取物对荷瘤小鼠生存率的影响　　 黑大蒜组荷瘤小鼠生存率明显高于对照组荷瘤小鼠。　　 4、黑大蒜提取物对荷瘤小鼠中性粒细胞ROS产生水平的影响　　 各组间中性粒细胞ROS水平均未见显著性差异(P＞0.05)。　　 5、黑大蒜提取物对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响　　 与荷瘤对照组(7.5±1.16%)相比,黑大蒜组NK细胞杀伤活性明显升高(23.98±6.15%),具有显著性差异(P＜0.001)。　　 6、黑大蒜提取物对荷瘤小鼠脾细胞培养上清中NO含量的影响　　 黑大蒜组(4.60±1.46μM)NO高于荷瘤对照组(2.21±1.39μM),具有显著性差异(P＜0.05)。　　 7、黑大蒜提取物对MethA、L929和3T3细胞生长的影响　　 黑大蒜提取物处理24h后MethA和L929细胞的生长抑制率随提取物浓度的升高而呈线性增加,而作为正常对照的3T3细胞的增殖抑制率随浓度变化不明显(虽有变化)。　　 8、黑大蒜提取物对MethA细胞周期的影响　　 黑大蒜组G1期细胞百分率(26.64±1.24%)约为对照组(14.13±1.02%)的2倍(P＜0.001)。黑大蒜组G2期细胞百分率较对照组也有所升高(P＜0.05)。黑大蒜组中S期细胞百分率(37.19±3.19%)明显低于对照组(55.24±2.11%),具有显著性差异(P＜0.001)。　　 9、黑大蒜提取物对MethA细胞凋亡的影响　　 黑大蒜组中凋亡细胞百分率(13.31±0.51%)较对照组(9.23±1.21%)增加,具有显著性差异(P＜0.001)。　　 结论：　　 1、黑大蒜提取物对小鼠中性粒细胞活性未显示增强作用,提示黑大蒜提取物可能不通过中性粒细胞发挥抗肿瘤作用。　　 2、黑大蒜提取物可提高MethA荷瘤小鼠生存率,增强荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性,促进脾细胞分泌NO,提示黑大蒜提取物可能通过增强NK细胞和巨噬细胞活性发挥抗肿瘤作用。　　 3、黑大蒜提取物具有抗纤维肉瘤作用且具有浓度依赖性。　　 4、黑大蒜提取物将MethA细胞周期阻滞在Gl期和G2期,S期细胞明显减少,且诱导MethA细胞凋亡,提示黑大蒜提取物可能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖。