论文部分内容阅读
目的:碳黑是一种在空气不足的情况下,碳氢化合物的不完全燃烧或热裂解而生成的无定形碳。碳黑具有良好的稳定性和惰性,因此被广泛使用,例如用于制造油墨,油漆和橡胶增强剂等。在毒理学研究中,碳黑因其低毒性和低溶解性而常被用作阴性对照。然而,研究表明,碳黑可诱发肺部炎症和组织病理学损害,例如纤维化。在我们之前的研究中,我们发现小鼠吸入碳黑14 d后肺泡壁增厚和胶原沉积。尽管碳黑颗粒可诱导肺纤维化,但确切机制尚不清楚。Micro RNA（miRNA）是一种非编码RNA,通过与靶基因m RNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合而负向调控靶基因的表达。miRNA在多种生理和病理过程中都起着重要作用,包括细胞凋亡,细胞分化,细胞增殖和纤维化进程。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是一种动态可逆的RNA修饰方式,作为真核生物中丰度最高的RNA修饰方式成为新的研究热点。m6A可以在转录后调控中发挥作用,调控miRNA的成熟过程。本研究建立口鼻式暴露碳黑SD大鼠模型,探讨碳黑对肺纤维化的作用及机制,为颗粒物对健康损害及相关人群健康的风险评估提供科学依据。方法:1. 颗粒物的表征使用Tecnai G220透射电子显微镜测量纳米级碳黑颗粒的尺寸和形态;并通过扫描电子显微镜观察其表面形态。使用Brunauer-Emmett-Teller（BET）吸附等温式计算纳米级碳黑颗粒的比表面积。2. 动物模型建立将SD大鼠随机分为对照组,暴露组和恢复组。暴露组和恢复组的动物分别放置在口鼻式暴露腔中,每天6 h。5 mg/m3暴露组的大鼠连续吸入28 d。30 mg/m3暴露组的大鼠分别连续暴露14 d,28 d和90 d。恢复组的大鼠暴露于碳黑90 d后,再恢复14 d。同时,各组相应的对照组放置于洁净空气中（6 h/d）。3. 细胞培养及细胞模型建立人支气管上皮细胞株16HBE于含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2饱和湿度下培养。选对数生长期的细胞,用碳黑染毒处理24 h,剂量为50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L;以DMEM为阴性对照。4.重组细胞株的建立:用50 n M miR-126 mimic转染16HBE细胞48 h,建立miR-126过表达细胞株。用PIK3R2 si RNA转染16HBE细胞48 h,建立PIK3R2低表达细胞株。5.肺功能测定使用Ani Res2005肺功能系统对动物肺功能进行评估。用戊巴比妥钠麻醉动物后,进行气管插管。然后将动物放入相应的密封的全身体描箱中,该描记器与Ani Res2005数据收集和分析系统相连,以监测动物相应肺功能指标。6.肺组织形态及病理学观察将大鼠肺脏用4%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中,然后切成5μm厚的切片。用苏木精和曙红（H&E）对其进行染色染色以评估病理变化。Masson染色用来评估胶原蛋白的沉积。7.纳米级碳黑颗粒对肺纤维化标志性蛋白表达的影响免疫组化和Western blot方法检测α-SMA、vimentin及Collagen-I蛋白表达。8.羟脯氨酸测定利用羟脯氨酸（碱水解法）测定试剂盒检测颗粒物染毒后,实验动物肺组织中羟脯氨酸含量的变化。9.Western blot检测大鼠肺组织或16HBE细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平高通量组织磨碎机在4℃下匀浆肺组织,用含1%PMSF的RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,采用Western blot方法检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR及p70S6K蛋白表达情况。10.荧光定量PCR检测大鼠肺组织或细胞中miRNA-126代谢过程以及RNA甲基化酶的水平Trizol提取细胞总RNA,miRNA 1st Strand c DNA和Go ScriptTM试剂盒分别反转录生成c DNA,实时荧光定量PCR检测miRNA-126、pri-miRNA-126、METTL3及METTL14的表达。11.RNA结合蛋白免疫共沉淀肺组织匀浆后,充分裂解。将磁珠与DGCR8或m6A抗体在室温下孵育30 min,然后与裂解细胞液充分混合,并在4℃下孵育过夜。而后将得到的蛋白质-RNA复合物用蛋白酶K消化,然后用苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1）提取RNA,并进行逆转录。最后,通过q RT-PCR分析pri-miRNA-126的表达水平。结果:1.颗粒物的表征通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）证实碳黑（CB）的尺寸为30到50 nm的球形颗粒,组成了数十到数百纳米的聚集体,但无中间体。BET结果显示碳黑颗粒比表面积约为74.85 m2/g。2.动物模型的建立实验动物全部存活,碳黑口鼻式吸入暴露模型建立成功。3. 大鼠的肺脏器系数变化脏器系数分析碳黑吸入染毒14 d开始,肺的脏器系数显著增加（P<0.05）,恢复14 d后,肺的脏器系数仍显著高于对照组（P<0.05）。在染毒28 d不同剂量组中,脏器系数随着碳黑颗粒浓度的增加而增大。4. 大鼠肺组织的病理变化高剂量染毒14 d、28 d和90 d后,大鼠肺组织内碳黑颗粒增多,肺泡壁增厚。肺泡腔内可见较多的巨噬细胞,单核细胞增多,聚集成团,吞噬黑色碳黑颗粒增多。胶原纤维沉积逐渐增加。恢复组大鼠病变程度与90 d染毒组相似,仍观察到肺泡间质内中有许多碳黑颗粒分布,胶原纤维沉积无明显变化。低剂量组染毒28 d后病理变化较高剂量组碳黑颗粒少,病变程度轻。5. 肺功能改变在本研究中,自碳黑暴露28 d以来,大鼠的肺功能指标:用力肺活量（FVC）、1 s用力呼气容积（FEV1）、FEV1/FVC%及用力中期呼气流速（MMEF）已有显着降低,提示肺内小气道阻塞、肺功能损伤。6. 纳米级碳黑颗粒对肺纤维化标志性蛋白表达的影响Western blot及免疫组化结果分析显示,碳黑吸入染毒后,肺纤维化标志性蛋白（α-SMA、Collagen-I和vimentin）表达量有剂量和时间依赖的显著增加（P<0.05）,恢复14 d后,蛋白表达量仍显著高于对照组（P<0.05）。同样,随着染毒浓度的增加,16HBE细胞中肺纤维化标志性蛋白表达量也随着碳黑颗粒浓度的增加而增大。7. 纳米级碳黑颗粒对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响Western blot结果显示,随着染毒时间的增加或者染毒浓度的升高,PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达量（PI3K、mTOR以及p-AKT、p-mTOR）表达量均逐渐升高（P<0.05）,与对照组相比,染毒组中AKT表达量没有显著差异（P<0.05）,为了进一步验证PI3K/AKT/mTOR信号通路在CB诱导的肺纤维化形成中的作用,在16HBE细胞中沉默了PI3K的表达。Western blot结果显示,在用si RNA干扰PI3K表达后,p-AKT,mTOR和p-mTOR的表达也随之降低（P<0.05）,但不影响AKT蛋白的表达（P>0.05）。当miR-126在16HBE细胞中表达上调时,PI3K的表达下调（P<0.05）。8. 碳黑处理后通过m6A抑制miRNA-126成熟的过程与对照组相比,大鼠肺组织和16HBE细胞中miR-126减少,而pri-miR-126则以时间和剂量依赖性方式增加（P<0.05）。在用DGCR8抗体进行RIP分析后,我们发现在碳黑处理组中DGCR8与pri-miRNA-126的结合显着降低（P<0.05）,这表明碳黑可以抑制DGCR8识别并结合pri-miRNA-126。用m6A抗体进行RIP后,我们发现碳黑处理组中m6A修饰的pri-miRNA-126的含量显著降低（P<0.05）,这表明碳黑可以抑制pri-miRNA-126的m6A修饰。q RT-PCR结果表明,随着碳黑处理时间或剂量的增加,METTL3和METTL14 m RNA的表达逐渐降低（P<0.05）,说明METTL3和METTL14可能与碳黑颗粒物导致pri-miRNA-126的m6A修饰降低有关。结论:1.大鼠吸入纳米级碳黑颗粒后,大部分碳黑颗粒沉积于肺间质内,少量存在于肺泡间。在恢复组中仍然可以观察到大量碳黑颗粒,表明短期内肺间质内碳黑不能被清除。2.纳米级碳黑颗粒经呼吸道染毒后可使大鼠肺组织出现不同程度的病理变化,肺泡壁和支气管结构紊乱。在肺泡腔内可见碳黑颗粒,巨噬细胞和单核细胞聚集,并且随着暴露时间的增加和剂量的增加,病理改变愈加明显。同时,随着暴露时间的增加,肺脏胶原纤维增加,呈现肺纤维化表现,在暴露90 d时,出现了包裹碳黑的纤维结节。3.纳米级碳黑颗粒染毒后,可使大鼠肺组织16HBE细胞miRNA-126表达量降低,并激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,引起肺组织纤维化。4.纳米级碳黑颗粒通过影响pri-miRNA-126的m6A修饰以及DGCR8和pri-miRNA-126的结合,抑制了miRNA-126的成熟过程。5.纳米级碳黑颗粒诱导的大鼠肺组织纤维化可能与METTL3和METTL14调节miRNA-126的甲基化并进一步影响其代谢有关。