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化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）是昆虫感受系统中的重要蛋白，是昆虫适应环境并与寄主植物协同进化的结果。对CSPs结合特性的研究有助于阐明昆虫的化学感受机理，加深对昆虫化学感受机理的认识，为开发以CSPs为靶标的农药提供思路，同时为有害生物综合治理（integrated pest management，IPM）提供理论和实践指导，从而适应农业持续发展和害虫种群持续控制的要求。本文利用计算机模拟的方法确定小菜蛾（Plutella xylostella）化学感受蛋白1(PlxyCSPl)的突变位点，据此设计一组用于点突变的重叠延伸引物。采用重叠延伸PCR(overlapextension PCR，OE-PCR)法扩增得到突变蛋白的成熟肽编码区用于构建表达载体，诱导表达的原始蛋白和突变蛋白用Western Blot检测进行验证。采用色氨酸荧光猝灭法研究药剂与PlxyCSP1原始蛋白和突变蛋白的结合特性。
利用Discovery Studio2.0软件，构建了原始蛋白和突变蛋白的3-D模型并确定了结合位点，利用分子对接模拟了骆驼蓬碱、闹羊花素-III、鱼藤酮药剂分子与原始蛋白和突变蛋白分子的结合模型。模拟结果显示，药剂分子均能顺利的进入原始蛋白的结合口袋，同时，受体.配体相互作用能为正，说明这些药剂分子与原始蛋白均能形成稳定的结合构象。而突变蛋白由于空间结构改变，药剂分子不能进入结合位点，出现受体与配体分离的现象。同时受体-配体相互作用能均为零，说明这些药剂分子不能与突变蛋白形成稳定的结合构象。由此可知，Cys残基对维持PlxyCSP1的结构和功能有重要意义，因此本实验选择的突变位点如下：半胱氨酸残基Cys32(TGC)突变为色氨酸残基Trp32(TGG)的单突变蛋白PlxyCSPl-M1、Cys58(TGT)突变为Trp58(TGG)的单突变蛋白PlxyCSPl-M2以及Cys32突变为Trp32，同时Cys58突变为Trp58的双突变蛋白PlxyCSPl-M3。
根据实验室保存的pET28a-PlxyCSP1甘油菌PCR产物的测序结果和所选择的突变位点，设计并合成了一组重叠延伸引物，用于OE-PCR试验。根据OE-PCR原理，通过逐层添加引物PCR法和多层引物混合PCR法，得到单突变体PlxyCSPl-M1、PIxyCSPl-M2和双突变体PlxyCSPl-M3。PlxyCSP1、PlxyCSPl-MI(M2，M3)成熟肽编码区长度408bp。
构建了表达产物为N端融合His.Tag的表达载体pET32a-PlxyCSP1和pET32a-PlxyCSPl-M1(M2，M3)，表达蛋白的分子量均为35kDa左右，主要以可溶性蛋白形式存在。优化了原核表达条件，确定了15℃以0.2 mmol/L IPTG诱导4h为最佳表达条件。表达的蛋白用Western Blot检测进行验证。
应用内源色氨酸荧光猝灭法研究原始蛋白PlxyCSP1和突变后蛋白PlxyCSPI-MI(M2，M3)与印楝素、鱼藤酮、骆驼蓬碱3种药剂的结合特性。结果表明:3种药剂对PIxyCSP1的荧光强度存在猝灭效应，而且随着药剂浓度的增加，猝灭效应增强。对于突变后的蛋白PlxyCSPl-Ml(M2，M3)荧光猝灭效应不明显。荧光猝灭的结果显示，原始蛋白PlxyCSP1能与3种药剂结合，而突变蛋白PlxyCSPl-Ml(M2，M3)与药剂分子的结合能力下降，这与计算机模拟的结果相符。由于本实验选择的突变位点为Cys32和Cys58，因此可以推测Cys残基在维持PlxyCSP1的结构和功能上起着重要的作用。