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香蕉枯萎病是一种危害严重的维管束病害，严重威胁世界众多国家香蕉产业的发展。利用有益微生物防治香蕉枯萎病是目前该病害防治研究的一个重要方向，地衣芽孢杆菌201为香蕉的一株内生菌，在平板对峙及盆栽试验中均表现出较强的抑制作用。本文从定殖动态、微生态学、诱导抗病性、抑菌物质分离纯化等方面对生防菌201的作用机理进行较为系统的研究，结果如下：
⑴用抗利福平(Rif)标记菌株201接种香蕉苗，分析菌株201在香蕉根际土壤及植株体内的定殖动态，初步明确该菌株的定殖情况，随着时间的推移，菌株201在植株体内的数量呈“先增后减”变化趋势。在此基础上，进一步用绿色荧光蛋白标记研究菌株201在香蕉体内的定殖动态和分布动态，结果表明，菌株201可以通过灌根处理进入香蕉体内，在植株体内及根际土壤中均表现出良好的定殖状况，能够在香蕉体内繁殖传导。菌株201在灌根接种后7d可以从香蕉植株根、茎中分离到标记菌株，叶片中几乎无标记菌株，14d后可以在叶片中分离到标记菌株。从整个定殖动态来看，菌株201在香蕉根、茎、叶部位的含菌量呈先增后减趋势，21d时菌量达到最高峰，之后逐渐减少，40d后仍可从香蕉植株根、茎组织中分离到标记菌株。组织切片观察到菌株201的定殖部位集中在香蕉组织的细胞间隙及细胞内。
⑵菌株201的悬浮液(1.0×109cfu/mL)灌根接种在香蕉苗根围，以无菌水处理为对照。常规管理，分别在7d、14d、21d、28d、35d、42d采取香蕉根围土样，分析香蕉根围土壤脱氢酶、脲酶、过氧化氢酶活性的变化。结果表明：(1)菌株201对香蕉根围土壤中脱氢酶的影响较小，灌根接入后酶活呈先增后减变化趋势，前30d内，低于清水对照，之后超过对照。(2)土壤中脲酶活性在灌根接入菌株201后28d内低于清水对照，之后超过对照。(3)土壤中过氧化酶活性在灌根接入菌株201后几乎无影响，处理与对照的酶活曲线变化都比较平稳。
⑶菌株201悬浮液(1.0×109cfu/mL)灌根接种在香蕉苗根围，以无菌水处理为对照，分别于接种后10d、20d、30d采取香蕉根围土样。采用平板稀释法计数土壤样品中真菌、细菌、放线菌群体数量，结果表明：(1)处理植株根围土壤中的真菌数量普遍低于对照植株根围土壤中真菌的数量，随着香蕉植株的生长，处理植株和对照植株根围土壤中的真菌数量都在增加。(2)接种后10d内，处理植株根围土壤中的细菌总量显著高于清水对照，但随着香蕉的生长，对照土壤中的细菌数量逐渐增加，而处理的土壤中的细菌数量略有减少，最终两种土壤中的细菌数量处于持平状态。(3)菌株201接种后土壤中放线菌的数量变化不大，随着香蕉植株的生长，处理和对照土壤中的放线菌数量都在增加，两者间无显著差异。
⑷菌株201灌根接种香蕉植株，20d后从香蕉根围采取土样，运用T—RFLP技术分析土壤中微生物类群结构的变化，以无菌水处理为对照。结果表明，菌株201作用后，香蕉根围土壤微生物种群结构发生了一些变化，8种细菌的菌量上升，23种细菌菌量下降或消失。
⑸菌株201浸根接种香蕉苗，分别在处理后1d、2d、3d、4d、5d、10d采香蕉根、茎、叶部样品，分析样品中过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的酶活变化，以无菌水处理为对照。结果表明，菌株201浸根接种香蕉苗后，香蕉根、茎、叶中POD、PAL、PPO三种抗病相关酶的酶活较清水对照均有不同程度地升高，处理后3—5d上升达到最高水平。从酶活增值来看，植株的根部相对叶、茎组织增加更为明显。
⑹通过分析生防菌201抑菌物质的胞内外分布、分子量大小及理化性质，明确其活性物质为胞外代谢物，且为大分子蛋白类物质。随后，采用硫酸铵分级沉淀去除菌株201胞外粗蛋白中的大量杂蛋白，过DEAE—Sepharose FF阴离子交换柱得到有活性的蛋白峰，SDS-PAGE检测发现未达到蛋白纯，进一步将此蛋白峰上样于Sephacryl S—100凝胶柱，最终获得条带单一的活性蛋白，表观分子量为48KDa，经MALDI-TOF—MS质谱鉴定预测为丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶能引起香蕉枯萎病菌菌丝形态发生畸变，对照的菌丝生长茂盛、表面光滑、形状均匀，而经抑菌蛋白处理的菌丝变得稀疏、扭曲膨胀，细胞壁破裂，原生质外溢，少数部位呈念珠状。
⑺根据菌株201活性蛋白N末端氨基酸序列及GenBank报道芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶C末端高保守性序列，设计引物，从菌株201基因组中克隆出编码该抑菌蛋白的基因。测序结果表明，基因序列全长为1329bp，编码442个氨基酸，与国外报道的一例来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(GenBank登陆号：CP000560)的AprX基因的同源性较高。
⑻目的基因两端引入酶切位点，克隆至PMD18-T Simple载体中，与表达载体pET28b同时双酶切后定向连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建目的基因的表达载体，测序结果表明接头和读框完全正确。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示有很强的特异表达产物带。生物学活性表明，该目的蛋白对香蕉枯萎病菌菌丝生长具有一定的抑制作用。