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芒果(Mangifera indicaL.)位居世界五大水果之列,为第二大热带水果。芒果产业是热区重要的特色农业支柱产业之一。由胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeosporioides Penz.&Sacc)引起的炭疽病是为害世界各地芒果最为严重的病害之一。但有关该病菌的致病机理以及其致病性相关基因方面的报道极少。黑色素化的附着胞是炭疽菌直接侵染寄主的主要途径。本实验研究了胶孢炭疽菌附着胞形成和黑色素合成相关的两个致病基因谷氨酸转运蛋白基因Cgglt1和转录基因CgMR1,获得了其全长序列,并通过插入gfp::hygB替换靶标基因的方法构建了敲除载体,通过转化原生质体、含hygB的SR平板筛选、特异性引物PCR验证获得Cgglt1和CgMR1基因各1个敲除突变体,通过测定多项表型分析了其致病相关功能,为揭示C.gloeosporioides的致病机理提供一定的学术价值,也为后续寻求防治该病害的新靶标打下良好的理论基础。主要结果如下:1.芒果炭疽病菌谷氨酸转运蛋白Cgglt1基因生物学信息分析参照橡胶树炭疽病菌HBCg01基因组数据,利用同源克隆策略,通过PCR技术获得Cggltl基因DNA全长序列,大小为3114bp,与HBCg01菌株中的相应基因有68个差异位点,其中从ATG-TGA是2162bp,5’端上游序列482bp,3端下游序列464bp;Cgglt1与NCBI网站中草莓胶孢炭疽菌的谷氨酸转运蛋白的mRNA相似性为99%,且含有GLT序列的3个典型保守结构域。2.芒果炭疽病菌谷氨酸转运蛋白Cgglt1基因功能分析借助In-Fusion HD(?)Cloning Kit,将Cggltl基因的5端片段、3端片段与gfp:hygB基因片段重组,成功构建了芒果炭疽病菌谷氨酸转运蛋白Cgglt1基因的敲除载体pCgglt1GH1。从该载体上扩增一段含有gfp::hygB基因的重组片段,采用聚乙醇介导的原生质体转化法转化芒果炭疽病菌原生质体,对所得转化子通过在含潮霉素的SR平板上筛选、PCR验证及目标条带测序,筛选获得敲除突变体ΔCgglt1。表型分析显示,与野生型相比,突变体ΔCgglt1菌落颜色由灰褐色变为白色,菌丝生长速率有所降低;菌丝颜色变浅、粗细未发生变化、分枝和分隔数减少;产孢量以及产孢速度明显下降,孢子萌发后不能形成附着胞;菌丝的致死温度上升为55℃ 20min;pH适宜范围为6～8,较野生型(pH7～9)更适宜偏酸环境;对碳源的利用有所改变;失去了调节偏碱pH的作用;活性氧含量提高、抗紫外线的能力下降;纤维素酶的酶活略有下降;实时荧光定量分析表明PEL和Ecg的表达量分别为野生型的2.03和1.25倍,Cgglt1几乎不表达,其余基因表达量下降了 12%～44%,其中LAC1和PKS下降较多,分别下降了 44%和36%;刺伤接种菌饼于芒果古铜期、淡绿期叶片和成熟芒果表皮,致病力明显下降,但不刺伤则几乎不能致病。在适宜的生长温度、对孰源的利用、对高渗胁迫(除蔗糖和NaCl)和H2O2的抗性与野生型差异不大。说明谷氨酸转运蛋白基因Cgglt在芒果炭疽病菌中主要调控菌丝的生长、分化以及黑色素的合成,附着胞及分生孢子的形成,对pH、碳源利用、活性氧、抗紫外线、细胞壁水解酶的酶活以及对寄主的致病力。3.芒果炭疽病菌转录因子CgMR1基因生物信息学分析采用类似方法,获得芒果炭疽病菌转录因子CgMR1全长,大小3943bp,与HBCg01菌株中相应基因有42个差异位点,从ATG-TGA长3117bp,5’端上游序列425bp,3’端下游序列 395bp;与草莓胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)(XM 007283538.1)和瓜类炭疽菌(C.lagenarium)(AB024516.1)转录激活基因序列的相似性达81%～99%。4.芒果炭疽病菌转录因子CgMR1基因功能分析构建获得了其敲除载体pCgMR1GH1和敲除突变体ΔCgMR1。表型分析显示:与野生型相比,转录因子基因CgMR1突变体ΔCgMR1菌落颜色为纯白色,菌丝生长速率明显降低,菌丝颜色变浅、粗细也未发生变化、但分枝和分隔数减少;附着胞形成率下降且不黑化;菌丝致死温度为50℃ 20min;对碳源的利用有所改变,尤其对甘露醇的利用明显比野生型高,对果胶的利用略高于野生型;对氮源的利用略有改变;活性氧含量提高、对大部分高渗胁迫环境的敏感性比野生型更低;对H2O2的抗性明显降低;对紫外线抗性显著下降;纤维素酶的酶活明显下降;实时荧光定量分析表明CgMR1表达量接近于0,与黑色素合成相关的基因PKS、THN、SCD和LAC1的表达量下降了 67%～75%;PEL和ECG的表达量下降了 54%;刺伤接种菌饼于芒果叶片和成熟果实,致病力明显下降,但不刺伤则几乎不能致病。对产孢量以及产孢速度、孢子萌发速率、适宜的温度范围、pH基本不影响。说明转录因子基因CgMR1在芒果炭疽病菌中主要调控菌丝的生长、分化以及黑色素的合成、附着胞形成,碳氮源利用、高渗胁迫、活性氧、对H2O2和紫外线的抗性、细胞壁水解酶的酶活以及对寄主的致病力。