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目的:通过体内外实验研究黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染的作用和机理。方法:1.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染雏鸭体内实验研究。筛选感染鸭乙型肝炎病毒的一日龄,重约50克/只的雄性龙岩麻鸭48只,随机分为病毒对照组,恩替卡韦治疗组(0.1mg/kg),黄芪注射液高、中、低剂量(20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg)联合恩替卡韦治疗组及单用黄芪注射液高剂量治疗组(20ml/kg)6个实验组,每组8只动物。于治疗前(T0),治疗7天(T7),治疗14天(T14),治疗21天(T21),停药5天(P5),停药10天(P10),停药20天(P20)测定病毒含量并进行比较。2.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15细胞体外实验研究。培养Hep G2.2.15细胞,将细胞分为病毒对照组,恩替卡韦治疗组(30nmol/L),黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组和黄芪注射液高、中、低剂量治疗组(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml)共8个实验组,每组设9个复孔,用CCK8比色法检测用药组细胞的增殖情况。分别于用药第3天(T3),停药第3天(P3),用PCR荧光探针方法检测各组细胞上清和细胞内HBVDNA。3.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究之Hep G2和Hep G2.2.15细胞体外实验研究。培养Hep G2细胞和Hep G2.2.15细胞。将未转染乙肝病毒的Hep G2细胞作为空白对照组细胞,转染了乙肝病毒的Hep G2.2.15细胞作为用药组和病毒对照组细胞,将细胞分为空白组,恩替卡韦治疗组(30nmol/L),黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组和黄芪注射液高、中、低剂量治疗组(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml),病毒对照组共9个实验组,每组设6个复孔。用药培养3天,将其中每组3个复孔细胞消化、裂解等处理后,应用荧光定量PCR方法检测药物对Hep G2.2.15细胞JAK-STAT通路信号m RNA的影响,另3个复孔细胞消化、裂解等处理后,用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法检测药物对细胞内NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的影响。4.黄芪注射液联合恩替卡韦对刀豆蛋白ConA造成的NIH小鼠免疫性肝损伤实验研究。购买72只雄性NIH小鼠,随机分为正常对照组,恩替卡韦治疗组(45μg/kg),黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组,黄芪注射液高、中、低剂量治疗组(1.5、1、0.5ml/10g),模型对照组,9个实验组,每组8只动物。除正常对照组外,其余小鼠尾静脉注射Con A20mg/kg后,分别于首日上、下午和次日下午各灌胃给药一次,末次给药后4h,模型组和各给药组小鼠一次性静脉注射Con A20mg/kg,禁食、不禁水,8h后摘小鼠眼球取血,离心分离血浆。测血浆中ALT、IFN-γ、TNF-α、SOD、MDA、NO,统计给药前和给药之后的变化。测各组小鼠的肝脏、脾脏、胸腺系数均值并进行对比,取肝左叶组织,10%甲醛溶液固定,电镜下观察病理切片组织结构的改变。随机取每组3只小鼠除肝左叶以外的剩余肝脏100mg,研磨、裂解等处理后应用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法观察各组肝细胞内NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的变化。结果:1.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染雏鸭体内实验研究。本次实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定;黄芪注射液联合恩替卡韦三个剂量组及恩替卡韦组在治疗7天后鸭血清DHBV-DNA均出现明显下降趋势,与相同时间的病毒对照组相比较具有显著性差异(P<0.01);黄芪注射液联合恩替卡韦组三个剂量组病毒载量的回升出现在停药20天以后,在停药5天、10天后并没有出现病毒的明显反跳,与相同时间的病毒对照组和给药前相比较具有显著性差异(P<0.01),说明黄芪注射液联合恩替卡韦组三个剂量组都可以延缓DHBV-DNA反弹,其中黄芪注射液中剂量联合恩替卡韦组最为明显;而恩替卡韦组则在停药5天后病毒就出现明显的反弹;单独用黄芪注射液高剂量组在治疗21天后鸭血清DHBV-DNA均未出现明显下降趋势,与相同时间的病毒对照组相比较没有显著性差异(P>0.05),这说明黄芪注射液本身抗病毒作用微弱。2.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15细胞体外实验研究。根据预实验结果,确定恩替卡韦作用浓度为30nmol/L,黄芪注射液作用高、中、低三个浓度为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml。用药3天,恩替卡韦可以抑制细胞内、外HBVDNA分泌,与病毒对照组比较有差别(细胞内P<0.01、细胞外P<0.05)。停药3天,细胞内、外HBVDNA定量反弹,和病毒对照组比较无差别(P>0.05)。用药3天,黄芪注射液各剂量组对细胞内、外HBVDNA无抑制作用,与病毒对照组比较无差别(P>0.05)。用药3天,高、中剂量的黄芪注射液联合恩替卡韦可以抑制细胞内、外的HBVDNA的分泌,与病毒对照组比较有差别(细胞内P<0.01、细胞外P<0.05)。停药3天,HBVDNA的反弹明显(P<0.05),除高剂量黄芪注射液联合恩替卡韦细胞外HBVDNA定量小于病毒对照组(P<0.05)。余用药组细胞内、外HBVDNA与病毒对照组无显著差别(P>0.05)。这说明高剂量的黄芪注射液联合恩替卡韦有停药后延缓细胞外HBVDNA反弹的效果。3.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究之HepG2和Hep G2.2.15细胞体外实验研究。较之空白组细胞,病毒对照组JAK-STAT通路的ISGF3m RNA的表达下降(P<0.05),余m RNA变化不明显(P>0.05)。较之病毒对照组,恩替卡韦组可使STAT2 m RNA表达增强(P<0.05),余用药组无影响(P>0.05);恩替卡韦组和黄芪注射液中、低剂量联合恩替卡韦组可使ISGF3m RNA表达增强(P<0.05);各组用药对STAT1、OAS、PKR三个m RNA均没有影响(P>0.05)。病毒的感染使得细胞JAK-STAT通路的m RNA表达受到了影响,主要表现在ISGF3基因表达的减弱,而黄芪注射液中、低剂量联合恩替卡韦组可以使其表达恢复正常(较之空白对照组P>0.05),恩替卡韦虽然也可以增强其表达,但是效果弱于联合用药组(较之空白对照组P<0.05)。黄芪注射液联合恩替卡韦对HepG2.2.15细胞炎性反应蛋白的影响。较之空白对照组,病毒对照组各蛋白表达除Caspase3差异无统计学意义(P>0.05),其余蛋白的表达均上升明显(P<0.01)。较之病毒对照组,黄芪注射液低剂量联合恩替卡韦组NF-κB下降(P<0.05);恩替卡韦组、黄芪注射液中剂量联合恩替卡韦组、黄芪注射液中、低剂量组OAS均下降(P<0.05或P<0.01);黄芪注射液低剂量联合恩替卡韦组、黄芪注射液高剂量组PKR下降(P<0.05);余用药组对NF-кB、OAS、PKR无影响(P>0.05),各用药组对Caspase3无影响(P>0.05)。4.黄芪注射液联合恩替卡韦治疗刀豆蛋白(Con A)造成的NIH小鼠免疫性肝损伤实验研究。较之正常对照组,模型组ALT升高了。较之模型组,黄芪注射液小剂量组以外各用药组均能明显降低小鼠ALT(P<0.05)。较之恩替卡韦组,黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组和恩替卡韦对ALT的降低作用相当(P>0.05),余有效用药组效果更差(P<0.01)。较之正常对照组,模型组SOD、MDA、NO均上升(P<0.01)。较之模型组,各组均能降SOD(P<0.01);除黄芪注射液小剂量组以外,各组均能降MDA(P<0.01);各组均能降NO(P<0.05或P<0.01)。较之恩替卡韦组,各组降SOD作用小于恩替卡韦(P<0.05或P<0.01);各组降MDA作用黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组作用和恩替卡韦组相当(P>0.05),余用药组效果小于恩替卡韦(P<0.01);各组降NO作用黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组和恩替卡韦组效果相当(P>0.05),余用药组效果小于恩替卡韦组(P<0.05或P<0.01)。较之正常对照组,模型组TNF-α和INF-γ均明显升高(P<0.01),较之模型组,恩替卡韦组(P<0.01),及高、中剂量黄芪注射液联合恩替卡韦组肝组织中的TNF-α显著降低了(P<0.05或P<0.01),其余各组对TNF-α没有显著影响(P>0.05)。较之恩替卡韦组,黄芪注射液高、中剂量联合恩替卡韦组降TNF-α效果与恩替卡韦组相当(P>0.05);各治疗组均对INF-γ有显著降低作用(P<0.01),黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组效果和恩替卡韦组相当(P>0.05),余用药组效果比恩替卡韦组更差(P<0.05或P<0.01)。较之正常对照组,模型对照组NF-кB、OAS、PKR、Caspase3均升高(P<0.01);较之模型对照组,恩替卡韦组NF-кB升高(P<0.05),余用药组无作用(P>0.05);除黄芪注射液低剂量组和黄芪注射液中剂量联合恩替卡韦组对OAS无影响(P>0.05),余用药组均降低了OAS(P<0.05或P<0.01);黄芪注射液中、低剂量联合恩替卡韦组PKR升高(P<0.05或P<0.01),黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组、黄芪注射液高剂量组PKR降低(P<0.05),余用药组PKR无变化(P>0.05);各用药组均对Caspase3无影响(P>0.05)。肝脏系数,较之正常组,模型组肝脏系数明显增高(P<0.01);较之模型组,恩替卡韦组和黄芪注射液低剂量组较之模型组有明显的增高(P<0.01),黄芪注射液中剂量组和黄芪注射液低剂量联合恩替卡韦组没有变化(P>0.05),黄芪注射液高、中剂量联合恩替卡韦组、黄芪注射液高剂量组有显著的降低作用(P<0.01);较之正常组,经黄芪注射液高剂量联合恩替卡韦组治疗后肝脏系数几乎没有变化(P>0.05)。脾脏系数,较之正常组,模型组脾脏系数明显增高(P<0.01);较之模型组,恩替卡韦和黄芪注射液低剂量组有明显的增高(P<0.01),黄芪注射液中剂量组和黄芪注射液低剂量联合恩替卡韦组没有变化(P>0.05),黄芪注射液高、中剂量联合恩替卡韦组和黄芪注射液高剂量组有显著的降低作用(P<0.01或P<0.05)。胸腺系数,较之正常组,模型组胸腺系数明显降低(P<0.01);较之模型组,恩替卡韦和黄芪注射液低剂量组有明显的降低(P<0.01),黄芪注射液中剂量组没有变化(P>0.05),联合用药组和黄芪注射液高剂量组可以明显升高胸腺系(P<0.01)。肝脏病理切片,各用药组和正常组相比较,存在着组织的病理损伤(P<0.01),各用药组和模型组相比,病理损伤减轻(P<0.01)。结论:黄芪注射液联合恩替卡韦具有很好的抗乙型肝炎病毒感染的作用,其疗效优势在于不仅可以很好的抑制乙型肝炎病毒的复制,而且可以在停药后延缓乙型肝炎病毒的反弹。有关的作用机理包括调节JAK-STAT通路m RNA表达和免疫应答所产生的抗病毒细胞因子和蛋白。黄芪注射液联合恩替卡韦对免疫性肝损伤有较好的降谷丙转氨酶、炎性反因子、炎性反应蛋白及保护肝细胞作用,总体来说,其抗病毒、护肝、调节免疫反应的综合疗效较之单独使用这两种药物要好。黄芪注射液联合使用或单独使用,抗病毒和免疫调节的疗效均呈剂量依赖性,实验证实,高、中剂量的黄芪注射液使用抗病毒总体效果较好,低剂量的黄芪注射液免疫激发作用更加突出。本实验提示临床使用黄芪注射液根据慢性乙型肝炎患者的病情需要灵活掌握使用浓度可控制药效不同的发挥方向。两药物联合使用可能比单独使用恩替卡韦或黄芪注射液更加安全有效,其作用还有待临床试验的验证。