【摘 要】
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目的:研究Rab25与结直肠癌化疗耐药的关系,为逆转结直肠癌化疗耐药寻找新的基因靶点。方法:构建结直肠癌化疗耐药株,观察耐药株形态,使用MTT比色法鉴定耐药株的耐药性,计算耐药指数。使用全转录组测序技术对耐药株和亲本株进行测序,比较筛选出与结直肠癌细胞耐药相关的GTP酶家族基因,选择Rab25作为研究目的基因。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）和免疫蛋白印迹（Western Blo
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目的:研究Rab25与结直肠癌化疗耐药的关系,为逆转结直肠癌化疗耐药寻找新的基因靶点。方法:构建结直肠癌化疗耐药株,观察耐药株形态,使用MTT比色法鉴定耐药株的耐药性,计算耐药指数。使用全转录组测序技术对耐药株和亲本株进行测序,比较筛选出与结直肠癌细胞耐药相关的GTP酶家族基因,选择Rab25作为研究目的基因。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）和免疫蛋白印迹（Western Blot,WB）分别从RNA和蛋白水平验证目的基因Rab25在亲本株和耐药株里面的表达水平。通过GEPIA2基因表达谱交互分析TCGA-COAD数据集中的Rab25表达水平与结直肠癌总生存期和耐药标志蛋白的关联性,初步验证Rab25与结直肠癌耐药的关联性。通过构建Rab25质粒,对耐药株进行转染,再次通过MTT检测结直肠癌耐药株的耐药指数。进一步通过流式细胞术检测Rab25在抗癌药物5-Fu和DDP干预耐药株时对耐药细胞株的细胞周期变化和细胞凋亡的情况。结果:1、MTT显示HCT-8/DDP在各浓度DDP处理下存活率均高于HCT-8,HCT-8/Fu在各浓度5-Fu处理下细胞存活率均高于HCT-8（P＜0.01）。2、全转录组测序技术筛选显示HCT-8/DDP细胞GTP酶家族Rab25、Rab32和Rab38表达比HCT-8分别低12.36、7.10和7.15倍,HCT-8/Fu分别低10.29、7.40和5.88倍（P＜0.001）。3、GEPIA2基因表达谱交互分析表明Rab25表达水平与结直肠癌总体生存期呈正相关（HR=0.4,P＜0.05）,与结直肠癌耐药标志性蛋白ABCB11、ABCC1和ABCG2呈负相关（P＜0.01）。4、RT-PCR结果显示与HCT-8相比,耐药株Rab25 RNA水平明显降低,耐药株转染Rab25质粒后RNA水平表达明显增高（P＜0.001）。5、WB结果显示与HCT-8相比,耐药株Rab25蛋白表达量明显降低,转染Rab25质粒后耐药株蛋白表达量明显增高（P＜0.001）。6、MTT显示Rab25质粒转染后耐药细胞药物敏感性显著升高（P＜0.001）。7、流式细胞术显示转染Rab25使耐药株细胞耐药时S期和G2/M期降低,凋亡比例增加。结论:GTP酶Rab25是结直肠癌细胞耐药的关键基因之一,上调Rab25逆转结直肠癌细胞耐药涉及细胞周期变化和细胞凋亡,Rab25可作为结直肠癌耐药的关键靶向基因进行干预。
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