论文部分内容阅读
目的：构建成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor2, FGF-2)的真核表达质粒，检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响。方法：以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板，PCR扩增目的基因FGF-2，经BglⅡ、Sal I双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒，脂质体转染到C3H10细胞中，另设pIRES2-EGFP空载体转染组和空白细胞对照组。RT-PCR及Westernblot法检测各处理组FGF-2的表达水平，MTT法和流式细胞计数检测细胞的增殖活力及细胞周期分布，RT-PCR检测骨和软骨相关标准蛋白、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化，Western blot检测Ⅱ型胶原（collagenⅡ,ColⅡ）的表达，甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌情况。结果：重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实FGF-2正确插入相应多克隆区域；质粒转染C3H10细胞后，FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较两个对照组明显增高，细胞增殖活力明显增高（P<0.05），软骨相关标志物Ⅰ型胶原（collagenⅠ,ColⅠ）、ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)的mRNA水平较两个对照组均显著增高（P<0.05），骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）等成骨相关蛋白的mRNA转录水平无明显升高（P＞0.05），Wnt信号通路相关分子Wnt5a及Fzd8mRNA转录水平降低（P<0.05），FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染。结论：成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒，FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力，对C3H10细胞有成软骨效应，但短期成骨效应不明显，FGF-2对C3H10的生物学效应可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关。