目的:目前乳腺癌是威胁女性身心健康的高发恶性肿瘤,其发病率和死亡率在全世界范围内均呈现较快增长趋势,且发病年龄存在明显的年轻化趋势。正因为如此,人们对乳腺癌进行了大量深入的研究。尤其是占全部乳腺乳腺癌超过70%的ER阳性乳腺癌受到了最多等的关注。而内分泌治疗的依据就是ER可接受雌激素刺激,促进乳腺癌的发生发展。ER是核受体超家族成员,包括ERα和ERβ两种类型,其中ERα存在三种亚型,分别是ERα66、ERα46和ERα36。我们平常所说的乳腺癌ER阳性,实际上指的是ERα66阳性,即是ERα的全长表达,也是目前在乳腺癌中研究最多的ER亚型,通常研究中的ERα指的即是全长表达的ERα66。ERα66的结构包括:非配体依赖的转录激活区（AF-1,ligand independent activation function 1）;DNA结合域（DBD,DNA binding domain）,这个区域含有一个双锌指结构,调节此区域与特异DNA的结合;配体结合域（LBD,ligand binding domain）;依赖配体的转录激活区（AF-2,ligand-dependent activation function2）。AF-2与不同的配体结合会形成出不同的构像,从而决定靶基因转录所需要结合的辅激活因子和辅抑制因子,从而促进或抑制靶基因的转录。辅调节因子对ERα下游靶基因的调控起至关重要的作用。这就要求我们对ERα的辅调节因子要有更深入的研究。目前研究发现辅调节因子通常以复合物的形式存在,并非单一的因子。它们并不改变基因序列,而是通过染色质重塑（chromatin remodelling）或组蛋白修饰（histone modification）来诱导染色质结构改变,使染色质结构维持在活化状态或者非活化状态,从而促进或抑制基因的转录。染色质活化状态的标志包括:高水平的H3K4me、H4K16Ac等组蛋白修饰,这些组蛋白的修饰使染色质从折叠状态变为打开,从而使转录变得容易的进行下去。ERAP2是多种甲基化转移酶复合物的组成部分,目前研究最多的就是它与WDR5、ASH2L、RbBP5一起组成的WRAD复合物,该复合物是SET1/MLL家族复合物中的保守基团。SET1/MLL复合物家族主要是起H3K4甲基化的作用,是最早被确定与H3K4甲基化相关的复合物,目前认为它催化了细胞内绝大多数的H3K4甲基化。在无WRAD复合物存在的条件下,SET1/MLL仅有较弱的H3K4单甲基化作用,和WRAD复合物结合后,才会有较强的促H3K4二甲基化及三甲基化的作用。这可能与它们的空间构象有关。WRAD复合物中ERAP2通常以二聚体的形式存在,WRAD复合物和SET1/MLL一同围成一个通道样结构,而H3K4就被结合和固定在此通道中,SET1/MLL的催化域与H3K4结合,使H3K4发生甲基化。尤其是在ERAP2增多的情况下,会使H3K4三甲基化水平明显增高并更加稳定。ERAP2调控的下游靶基因与ERα存在较多的重合。我们推测ERAP2可能作为ERα的辅激活因子调控ERα下游靶基因的转录。我们围绕这一假设进行了相关研究,证实了猜想,并对ERAP2在乳腺癌细胞及组织中的生物学功能进行了解析,为乳腺癌治疗提供了新的思路和可能的靶点。方法:1.在GEO数据库进行数据挖掘,筛选出癌和癌旁差异表达基因,再与ER阳性乳腺癌早期复发和晚期复发差异表达基因进行合并分析,挑出三个数据库共同存在的差异表达基因前50位。最后确定以第36位的ERAP2作为研究的主要因子。2.在HEK-293、MCF-7、T47d细胞中构建荧光素酶双报告系统,检测ERAP2是否对ERα的下游靶基因有调控作用。3.用siERAP2敲除ERα表达阳性的乳腺癌细胞系MCF-7、T47d中的ERAP2,在加不加E2刺激的情况下用Realtime PCR和western blot分别检测ERα下游靶基因mRNA和蛋白水平的变化情况,以明确内源性ERAP2是否对ERα的下游靶基因有调控作用。4用蛋白免疫共沉淀实验检测ERAP2和ERα在细胞内是否互相结合,以明确二者之间的相互作用。5.免疫荧光染色ERAP2和ERα,用共聚焦激光扫描显微镜检查二者的细胞内定位及共定位情况。5.用染色质免疫共沉淀实验检测ERAP2是否和ERα一样能够结合在ERα靶基因的启动子ERE区域。6.用shERAP2慢病毒建立ERAP2稳定低表达的T47d、MCF-7细胞系,并进行细胞克隆形成实验、细胞生长实验以及用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况,明确ERAP2在乳腺癌细胞系中的生物学功能。7.用western blot检测乳腺癌组织和癌旁正常组织的ERAP2表达情况;用免疫组化法检测ERα阳性乳腺癌组织的ERAP2表达情况,并结合临床病理及预后资料分析,明确ERAP2在乳腺癌中的作用。结果:1.在HEK-293、MCF-7、T47d细胞中构建荧光素酶双报告系统,检测发现在给予10^-8M E2刺激下,外源性ERAP2增加能够使三种细胞ERα下游荧光素酶的活性明显升高,证实ERAP2有促进ERα下游基因转录的作用。2.在ERα阳性的MCF-7、T47d细胞中使用siERAP2敲除ERAP2,在加不加E2刺激的情况下用Realtime PCR检测ERα下游靶基因mRNA的表达水平,发现c-MYC、CyclinD1、CDK2、VEGF、CCNG2、TFF1表达均有不同程度的下降,且下降均具有统计学意义。我们用western blot检测ERα下游靶基因蛋白水平的变化情况,也发现表达有所下降,与mRNA表达相一致。从而证明内源性ERAP2能够促进ERα下游靶基因的转录表达。3.我们在T47d细胞中用ERα抗体进行蛋白免疫共沉淀实验,通过western blot检测到沉淀中有ERAP2蛋白存在;我们又在MCF-7细胞中使用ERAP2抗体进行蛋白免疫共沉淀实验,在沉淀中检测到了ERα蛋白以及WRAD复合物中的其他组分。证实了内源性ERAP2和ERα在细胞存在互相作用。提示ERAP2以ERα辅激活因子的形式与ERα结合,从而促进其靶基因的转录。4.免疫荧光染色ERAP2和ERα,用共聚焦激光扫描显微镜检查二者的细胞内定位及共定位情况。ERAP2定位于核,ERα在无E2存在条件下,大部分位于胞浆,在给予10^-8M E2刺激后,ERα入核与ERAP2共同定位于核,再次证实二者之间存在相互作用。5.用染色质免疫共沉淀实验,在提取出的DNA中用Realtime PCR,检测到ERAP2、ERα都结合在靶基因TFF1的启动子区域的ERE序列上,并促进H3K4三甲基化的水平升高,从而促进靶基因的表达。6.用shERAP2慢病毒建立ERAP2稳定低表达的T47d、MCF-7细胞系,进行细胞克隆形成实验发现ERAP2低表达细胞细胞形成克隆的能力减弱;细胞生长实验发现ERAP2低表达细胞生长速度减慢;用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况,发现敲除ERAP2后,细胞周期明显阻滞于G1期。表明ERAP2可以促进乳腺癌细胞的生长。7.用western blot检测乳腺癌组织和癌旁正常组织的ERAP2表达情况,发现癌组织ERAP2表达水平明显高于癌旁正常组织,这与数据挖掘得到的结果相一致;用免疫组化法检测ER阳性乳腺癌组织的ERAP2表达情况,并结合临床病理及预后资料分析,发现ERAP2高表达会促进乳腺癌细胞生长,拥有更晚的TNM分期（P<0.05）。结论:1.ERAP2作为ERα的辅激活因子与ERα结合,使H3K4me3水平升高,从而促进ERα靶基因转录。2.ERAP2协同调控乳腺癌细胞ERα靶基因CyclinD1,c-MYC,CyclinE,CDK2,TFF1,VEGF表达。3.ERAP2可以促进ERα阳性乳腺癌细胞的增殖和生长。