钾通道是一类广泛存在的跨膜蛋白,它们与细胞膜电位调控、肌肉收缩、腺体分泌、细胞体积控制、细胞增殖等生理病理活动紧密相关。大量通过分离纯化、基因工程或改造设计得到的多肽作为不可或缺的工具分子,在钾通道结构和功能关系研究中发挥了重要作用。然而,由于多肽-钾通道复合物晶体结构解析技术的挑战,它们相互作用机制的研究进展缓慢。本论文聚焦多肽与钾通道相互作用的新机制,综合运用分子生物学,细胞生物学、电生理学、生物信息学等技术,开展多肽与钾通道相互作用新机制的深入研究,以进一步促进多肽与钾通道相互作用研究与应用。在大量作用钾通道蝎毒素多肽(“蝎毒液来源的毒素多肽”的简称),仅发现少数蝎毒素能特异性识别小电导钙激活钾通道(SK),而经典蝎毒素如Charybdotoxin (ChTX)几乎不作用SK钾通道。这种蝎毒素选择性识别SK通道的结构基础至今尚未得到研究。在蝎毒素层面上,我们以蝎毒素BmP05为分子工具,发现了蝎毒素活性表面上碱性氨基酸数目不超过3个。如果在蝎毒素BmP05(IC50为3.76±1.24nM)活性表面增加1-2个碱性氨基酸后,100nM蝎毒素BmP05突变体仅能阻断8.7-30.5%的SK3钾通道电流。在SK3钾通道层面上,试验发现了两个保守碱性氨基酸(R485和R489)在毒素选择性识别过程中发挥了决定性作用。以碱性氨基酸(His或Lys)分别置换R485或R489虽然能降低突变体通道对多肽BmP05的亲和性,但突变体通道仍然保留类似野生型SK3通道的毒素敏感性。相反的是,当R485或R489分别置换为酸性氨基酸(Glu)或亲水氨基酸(Ser)后,突变体通道丧失了对多肽BmP05的敏感性而获得对不敏感蝎毒素ChTX的敏感性。在对SK3通道turret及孔区上氨基酸进一步扫描后发现,另外两个酸性氨基酸(D492和D518)对于毒素敏感性也具有重要影响。在此基础上,运用结构生物信息学方法研究发现,R485和R489通过分别与D492和D518形成“盐桥”静电相互作用,在SK3通道turret上形成了一外一内的两个正电荷环(我们称之为“多肽筛选器”)。这个多肽筛选器结构从空间定位和电荷排斥两个方面限制了识别SK3通道的毒素类型,从而阐明了SK3通道选择性控制蝎毒素识别的结构基础。在目前已知作用SK通道的蝎毒素多肽(如scyllatoxin、BmP05等)中,它们主要以a螺旋为活性表面特异性阻断SK钾通道。本实验室在前期的研究工作中对BmP05进行改造获得多肽BmP05-T,发现该多肽能以p折叠为活性表面作用Kv1.3通道(IC5o为22.01nM)。进一步的膜片钳实验显示了BmP05-T毒素仍能特异性阻断SK3通道(IC50为130.6nM),暗示了BmP05-T毒素以新的机制作用SK3钾通道。为了揭示BmP05-T与SK3通道相互作用的新特征,我们对蝎毒素BmP05-T的α螺旋及p折叠上相关碱性氨基酸进行点突变。结合膜片钳技术,测试突变体多肽药理学活性变化。实验结果显示,对BmP05-T多肽α螺旋上K6、R7、R13进行点突变,与野生型BmP05-T活性相比,突变体多肽活性变化均在6倍以内；而对BmP05-T多肽p折叠上K20、K25、K27进行点突变,突变体多肽对SK3通道活性变化均大于11倍,其中1μM多肽BmP05-T-K27A仅阻断8.40%的SK3通道电流。这些实验结果表明了蝎毒素BmP05-T采用了p折叠为活性表面识别SK3钾通道。在此基础上,我们运用NMR技术测定了蝎毒素BmP05-T的空间结构,并模拟了蝎毒素BmP05-T与SK3钾通道的相互作用。研究发现了蝎毒素BmP05-T的β折叠区域K27残基侧链伸入SK3通道孔区发挥“堵孔”功能,而α螺旋上K6、R7、R13残基远离SK3钾通道孔区。这些作用的结构新特征不仅阐明了蝎毒素BmP05-T以p折叠区域识别SK3钾通道的新机制,丰富了多肽与SK3通道相互作用模式的新认识,也为设计和改造靶向SK通道亚型特异性多肽阻断剂提供了新的研究方向。钾通道电流广泛地被外源动物毒素多肽(如蝎毒素多肽、蛇毒素多肽、海葵毒素多肽等)所抑制,然而人体内是否存在作用自身钾通道的多肽调节剂仍是一个未解之谜。基于蝎毒素与人源抗菌肽hBD2的结构共性,我们发现了1μM hBD2对钾通道Kvl.2、Kvl.3和KCNQ1电流分别能产生16.50%、95.71%和12.53%的抑制效果,而对IKCa、SKCa3和hERG则无抑制效果。浓度依赖试验表明了hBD2作用钾通道Kvl.3的IC50值达到22.07pM。钾通道嵌合体实验则进一步发现,hBD2除了能以经典堵孔方式作用Kvl.3通道S5-S6区域外,还能通过作用Kv1.3通道S1-S2linker影响通道通透钾离子。丙氨酸扫描实验显示,与经典堵孔毒素类似,hBD2可通过结合通道孙区外庭作用Kv1.3通道；离子通道动力学实验显示,hBD2还能够作用S1-S2linker上相关功能残基位点,通过静电排斥作用阻碍S4螺旋跨膜运动,影响通道激活、调节通道门控。据我们所知,这些实验结果第一次发现了作用人钾通道的内源性多肽,且具有作用钾通道S1-S2linker的新机制,从而为人和其它哺乳动物作用钾通道内源性多肽的发现及功能研究开辟了新领域。综上所述,本论文主要开展了多肽与钾通道相互作用新机制研究,阐明了SK3钾通道具有选择控制多肽识别的“多肽筛选器”结构,揭示了多肽BmP05-T以p折叠作为活性表面识别SK3通道新模式,发现了人内源多肽hBD2作用自身Kv1.3钾通道的新功能与新机制。这些研究发现不仅加深了我们对多肽和钾通道相互作用机制的深入了解,而且促进了靶向钾通道特异性多肽调节剂和药物的发现与功能研究。